《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：CRISPR-Based Versatile Strategies for Nucleic Acid Analysis and Disease Diagnosis: Mechanisms, Modalities, and Translational Horizons
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赵国龙|李金泽|傅思南|王翱翱|孟向丹|董海峰|张学军深圳市大学医学院生物医学工程学院、精准医学与健康研究所、马歇尔生物医学工程实验室、纳米生物传感技术深圳重点实验室、生物医学测量与超声成像广东省重点实验室，中国深圳518060摘要CRISPR系统最初作为基因编辑工具开发，如今因
赵国龙|李金泽|傅思南|王翱翱|孟向丹|董海峰|张学军
深圳市大学医学院生物医学工程学院、精准医学与健康研究所、马歇尔生物医学工程实验室、纳米生物传感技术深圳重点实验室、生物医学测量与超声成像广东省重点实验室，中国深圳518060
摘要
CRISPR系统最初作为基因编辑工具开发，如今因其作为核酸分析平台的强大功能而受到广泛关注，表现出高灵敏度、显著特异性和灵活的可编程性。在这篇综述中，我们总结了基于CRISPR的核酸检测和疾病诊断分析平台的最新进展。首先详细讨论了各种Cas酶的机制，以及定义目标特异性和区分能力的crRNA设计原理。接着介绍了结合不同信号输出模式（包括光学/电化学转换和基于智能手机的读数）的多功能CRISPR传感系统。随后，我们研究了CRISPR检测策略在不同生物环境中的应用，包括细胞内/体内递送方法以及应用于多种体液和临床样本的体外平台。最后，指出了CRISPR在定量、多重检测和稳健性方面的当前瓶颈，并讨论了将CRISPR与微流控、人工智能和混合系统结合的未来策略。
引言
核酸作为一种传输和翻译重要遗传信息的生物载体，在各种研究和临床应用中被视为重要的生物标志物[1]、[2]。在疾病诊断和健康管理方面，核酸检测技术能够快速检测并准确分析由遗传疾病引起的疾病，特别是心血管疾病[3]、人类癌症[4]和急性病原体感染[5]，从而提供早期干预和个性化治疗策略[6]。虽然传统的聚合酶链反应（PCR）、定量PCR（qPCR）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是核酸分析和量化的金标准方法[7]，但下一代测序（NGS）为病原体发现和基因突变分析提供了全面的信息[8]。然而，这些检测方法依赖于热循环、复杂的仪器设备、较长的周转时间和高昂的成本，限制了它们在即时检测（POC）和分散式环境中的应用[9]。为了解决这些问题，人们开发了等温核酸扩增方法，如环介导的等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和无酶DNA扩增化学方法[10]。同时，借助纳米技术的进步，各种纳米材料辅助的核酸分析方法也被广泛应用，包括金纳米颗粒（AuNPs）、磁性纳米颗粒（MNPs）和量子点（QDs）等[11]。尽管这些方法在减少对仪器依赖性和简化操作流程方面有所改进[11]，但它们在特异性、多重检测、一致性或集成到用户友好型平台方面仍面临挑战[12]。表1详细比较了各种应用于核酸检测的信号扩增策略。
1987年，Ishin首次发现了规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统[13]，并于2002年正式命名[14]。CRISPR系统作为一种全新的技术范式，引发了核酸检测领域的革命性变化[15]。CRISPR/CRISPR相关（Cas）系统是大多数细菌和所有古菌的适应性免疫防御机制，能够识别并破坏外来遗传元素（如质粒或噬菌体）[16]、[17]。最初，这些基于CRISPR-Cas的系统被广泛用作哺乳动物和多种物种中的强大基因编辑工具，最近又被重新用于分子诊断[18]、[19]。与传统扩增程序不同，CRISPR系统利用了Cas核酸酶（如Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等）的可编程识别能力，这些核酸酶在CRISPR RNA（crRNA）的引导下表现出高灵敏度、显著特异性和灵活的可编程性[18]。特别是Cas12和Cas13的附带切割活性可以识别单个目标分子并触发报告探针的无差别切割[20]、[21]。Cas12/Cas13参与的内源性酶促扩增机制使CRISPR系统成为多功能传感平台，能够将特定的核酸识别转化为多种信号输出，实现核酸的敏感和特异性检测[22]、[23]。
迄今为止，基于CRISPR-Cas的系统已与多种转导策略合理结合，构建了用于核酸检测的多功能分析平台。例如，光学信号输出（如荧光[24]和比色法[25]）提供了直观的检测结果，而电化学信号与CRISPR-Cas系统的结合则实现了微型化和定量平台[26]。数字分割[27]、智能手机集成[28]和质谱耦合[29]等新兴技术使得分子检测朝着绝对定量、连续监测和实时连接的方向发展。因此，通过选择合适的信号输出方式，研究人员和临床医生可以根据实验室研究、临床应用或现场部署的需求定制CRISPR诊断策略[30]。此外，得益于各种递送载体的发展，基于CRISPR的传感系统已广泛应用于不同的生物环境，实现了活细胞内[31]和体内[31]的核酸可视化监测，以及从体液（血液、唾液、尿液、间质液）或临床拭子中的快速检测[32]。
在这篇综述中，我们强调了基于CRISPR的分析系统在疾病诊断中的原理和多功能性（见图1）。根据临床应用场景的不同，我们明确区分了用于体外和体内检测的多功能CRISPR诊断平台，这与以往侧重于体外传感平台的综述有所不同[33]、[34]。这两种应用场景在工作原理、实验流程和实际限制方面存在显著差异，这些差异在文中进行了详细讨论。对于不同诊断环境中基于CRISPR的传感系统设计，我们总结了常见的样本类型、关键系统组件和设计考虑因素，并重点介绍了代表性的CRISPR传感平台。此外，检测环境对检测架构和整体系统性能的影响也是本文的重要内容。因此，我们提供了不同Cas酶机制的简要概述。同时，还介绍了基于CRISPR的传感平台在核酸检测和疾病诊断方面的最新研究成果，重点介绍了它们的工作原理和典型应用。通过将分子机制与实际检测场景相结合，本文为CRISPR介导的疾病诊断的系统级设计提供了补充视角。
部分片段
CRISPR系统的设计原理
作为检测工具，CRISPR主要依赖于crRNA和Cas蛋白的目标识别能力[58]、[59]。crRNA包含与目标序列互补的间隔区域，可以特异性地识别待检测的DNA或RNA[58]、[59]。在目标核酸存在的情况下，crRNA将Cas蛋白精确引导至目标位置，形成Cas蛋白、crRNA和目标核酸的复合物，从而切割目标核酸。值得注意的是，某些Cas蛋白
基于CRISPR的检测模式和应用
基于CRISPR的传感系统的一个关键问题是高效地将目标识别和附带切割转化为可靠且可量化的信号，以实现敏感和选择性的分子检测[132]。与传统核酸检测方法相比，基于CRISPR的分析平台具有更高的通用性，允许结合酶活性和多种转导策略，以满足对灵敏度、便携性和临床应用的不同要求
不同生物环境中的基于CRISPR的分析策略
尽管基于CRISPR的传感平台在核酸分析方面显示出显著的优势，但其部署必须适应在生物环境中直接分析目标分子的需求，要求具有高稳定性和抗干扰性。根据CRISPR组分在活细胞和体内的操作环境，或体液和体外样本中的环境，会遇到不同的挑战和机遇。活细胞或体内的生物分子的原位可视化监测尤为重要
挑战与前景
总之，基于CRISPR的核酸分析和疾病诊断传感系统已经迅速发展为多功能平台，其灵敏度可与PCR相媲美，支持从传染病检测到肿瘤诊断、食品安全和环境监测等多种应用[59]。Cas效应子和读数模式的持续多样化扩展了目标范围和部署形式，显示出广泛的适用性
CRediT作者贡献声明
张学军：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理。傅思南：正式分析。李金泽：正式分析。赵国龙：撰写——初稿，正式分析。董海峰：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，资金获取。孟向丹：撰写——初稿。王翱翱：正式分析
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了中国国家重点研发计划（编号2022YFB3207202和2023YFA0915700）、国家自然科学基金（编号22374102）、广东省珍珠河流团队（编号2021ZT09C289）和深圳纳米生物传感技术重点实验室（编号ZDSYS20210112161400001）的财政支持。
