综述：基于CRISPR/Cas系统的电化学生物传感器在病原体检测方面的最新进展

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Recent Advances in CRISPR/Cas-Based Electrochemical Biosensors for Pathogen Detection

　　

崔久英|程学青|郭新燕|李丹丹|徐子琪|钱万强|王照英|戴志辉

中国南京师范大学化学与材料科学学院生物医学功能材料江苏省协同创新中心，南京210023

摘要

病原微生物，包括细菌和病毒，仍然是传染病和食物相关疾病的主要原因。传统的病原体检测方法通常受到处理时间较长、交叉反应和操作复杂性的限制。电化学生物传感器作为一种变革性方法应运而生，提供了快速、经济高效且高度准确的识别能力。与此同时，CRISPR/Cas系统凭借其可编程的核酸识别和核酸酶活性，在病原体检测方面展现了显著潜力，尤其是与电化学生物传感器结合使用时。本文首先对病原体的生物靶标及其相应的扩增策略进行了分类，然后探讨了CRISPR家族成员在靶标识别和信号转导中的关键作用。此外，还重点介绍了基于CRISPR/Cas的电化学平台的最新进展，强调了在灵敏度、特异性和效率方面的改进，旨在为下一代病原体诊断生物传感器的发展提供灵感。

引言

病原微生物，也称为病原体，包括多种存在于食物中的细菌和病毒，是生物系统中许多疾病的主要致病因子[1]、[2]。病原体感染可引发从呕吐和恶心到恶性肿瘤和神经系统疾病等一系列临床表现[3]、[4]，可能危及生命[5]。目前，传统的病原体分析方法如培养检测[6]、[7]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]具有明显优势，但常常受到检测周期长、易发生交叉反应以及操作复杂性等限制。在这种背景下，电化学生物传感器因其出色的分析性能、易于操作和强大的实用性而受到广泛关注。

作为强大的分析工具，电化学生物传感器通过将特定的生物识别事件与电化学信号转导相结合，实现对目标分析物的灵敏检测。这些传感器的核心在于精确捕获和量化发生在生物实体与电极表面之间的短暂电化学信号[9]。在这一转导过程中，内置的识别元件（如核酸、酶和抗体）与转导元件（优化了生物材料的电极系统）紧密协作，将生物事件转化为电信号[10]、[11]。基于这一强大的技术基础，引入了循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（EIS）、方波伏安法（SWV）和差分脉冲伏安法（DPV）等电化学方法，用于监测界面过程，为病原体识别提供定量读数，并探究反应机制，从而共同促进了病原体检测策略的发展[12]、[13]、[14]。

近年来，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）已成为生物技术中的关键技术，并越来越多地应用于包括病原体检测在内的分子诊断[15]、[16]。CRISPR/Cas系统源自古菌的天然免疫机制，利用引导RNA介导对入侵核酸的序列特异性识别和切割[17]、[18]。除了在基因编辑中的作用外，这些可编程的识别和核酸酶活性还被广泛用于病原体检测[19]、[20]。通常，病原体的检测目标直接或间接被CRISPR识别，激活其酶活性。然后将该活性与电化学传感器结合，以捕获并解释由此类相互作用产生的电化学信号变化[21]、[22]、[23]。这种CRISPR辅助的电化学平台结合了高分析特异性、相对较低的成本和简单的操作性，在实际病原体诊断和更广泛的生物分析应用中显示出巨大潜力[24]、[25]、[26]。

通过全面研究现有研究，本文介绍了利用CRISPR/Cas系统进行病原体分析的电化学检测方法的最新进展。首先探讨了靶标提取和扩增策略，随后详细阐述了关键CRISPR/Cas系统的机制。文章进一步强调了电化学病原体传感平台的进展，重点介绍了针对各种重要细菌和病毒的靶标识别和信号转换途径，以及灵敏度、特异性和效率的显著提升。此外，还指出了当前的研究局限性，如需要提高检测灵敏度和稳定性、减少复杂样品中的干扰以及标准化和小型化检测系统。最终，这项工作旨在为未来的研究方向和技术趋势提供有价值的指导。

章节摘录

靶标提取和扩增策略

病原体检测依赖于识别特定的微生物相关生物分子，这些分子主要分为核酸（DNA/RNA）和暴露在表面的蛋白质[27]、[28]、[29]。为了实现这些目标的高灵敏度定量，电化学生物传感器通常整合了多种核酸扩增策略[30]、[31]、[32]。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统最初作为古菌的适应性免疫机制被发现，现已发展成为一种先进的RNA引导平台，用于DNA/RNA靶向、基因组编辑和病原体检测[70]、[71]。这些系统在其组成成分和分子作用机制方面表现出显著的多样性，这些成分和机制由Cas效应蛋白的亚型及其相应的辅助RNA共同决定。以下是代表性亚型的详细描述及其

信号转导策略

基于CRISPR/Cas系统的生物传感器的基本原理是利用Cas蛋白的核酸识别和切割活性来转换目标信号。具体而言，通过合理设计CRISPR/Cas系统（例如选择Cas蛋白亚型、设计引导RNA序列以及在传感平台上组装核酸报告探针），电极界面的特性变化与特定的识别和切割过程相关联

结论

集成CRISPR/Cas的电化学生物传感器作为一种颠覆性的病原体识别平台越来越受欢迎。这些系统结合了CRISPR/Cas的序列特异性可编程性和电化学转导的高灵敏度，能够在临床和环境环境中快速且高度精确地诊断关键病原体。这些生物传感器的模块化架构进一步增强了其多功能性，通过选择兼容的Cas蛋白实现个性化检测

CRediT作者贡献声明

程学青：撰写——初稿，概念构思。崔久英：撰写——初稿，可视化，概念构思。钱万强：监督，资金获取。徐子琪：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念构思。李丹丹：撰写——审稿与编辑。郭新燕：撰写——审稿与编辑。王照英：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。戴志辉：监督，资金获取

数据可用性

本文所述研究未使用任何数据。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22222407、22234005、22574079、22176099和22504063）、江苏省自然科学基金（BK20222015）、江苏省高校基础科学（自然科学）研究（25KJB150020）以及农业科技创新计划的支持。