PPAR亚型决定了邻苯二甲酸酯（PAEs）以及全氟和多氟烷基物质（PFAS）在干扰人体巨噬细胞替代激活（alternative activation）过程中的不同作用机制

《Toxicology》：PPAR subtypes determine distinct modes of action of phthalate esters (PAEs) and per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) in disrupting human macrophage alternative activation

本研究通过CRISPR/Cas9技术建立PPARα、δ、γ敲除的THP-1巨噬细胞模型，分化为IL-4/IL-13极化状态，测试了5种PAEs代谢物和5种PFAS的毒性，发现PPARδ是替代激活必需的，α促进而γ抑制该过程，揭示了PAEs和PFAS通过不同PPAR亚型调控巨噬细胞替代激活的分子机制。

　　

庄志森|游丽娟|孔建波|田亚茹|李永宁|志远|张波|万毅|贾旭东|杨慧

南方医科大学公共卫生学院，中国广州510515

摘要

邻苯二甲酸酯（PAEs）和全氟及多氟烷基物质（PFAS）是普遍存在的污染物，与代谢和免疫紊乱有关。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路已被证明可以介导它们的毒性作用，但PPAR亚型的具体功能及其介导作用仍不清楚。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9系统生成了PPARα、δ和γ特异性的THP-1细胞系，然后将其分化为白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）极化的巨噬细胞（替代激活型）。在诱导过程中，这些细胞分别暴露于0、6.25、12.5、25、50、100 μM的五种PAE代谢物：单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP）、单环己基邻苯二甲酸酯（MCHP）、单异丁基邻苯二甲酸酯（MIBP）和单苯基邻苯二甲酸酯（MBzP）；以及五种PFAS：全氟十一烷酸（PFUnDA）、全氟癸酸（PFDA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟辛烷磺酸钾（PFOS-K）和9-氯十六氟-3-氧杂壬烷-1-磺酸钾（F53B）中，持续时间分别为48小时。结果表明，PPARδ的缺失消除了CD209的表达，证实了其重要性；而PPARα的缺失降低了CD209的表达，PPARγ的缺失则增强了CD209的表达，表明PPARα促进替代激活，PPARγ则抑制替代激活。这些化合物表现出亚型选择性作用：MEHP激活PPARα/γ；MBzP/MCHP抑制PPARδ但激活PPARγ；MINP仅激活PPARγ。在PFAS中，PFOS-K激活PPARδ/γ；F53B抑制PPARα；PFOA激活PPARγ；PFDA抑制PPARα/δ。转录组分析显示，尽管这些化合物都参与了PPAR通路，但它们在特定基因表达上存在差异——如胆固醇（MEHP）、脂肪酸（MCHP）和糖酵解（PFOS-K）相关基因的表达增强，而TCA循环（PFOA）相关基因的表达减弱。总之，PAEs和PFAS通过不同的PPAR亚型特征干扰巨噬细胞的可塑性，为未来环境污染物的危害评估提供了分子依据。

引言

邻苯二甲酸酯（PAEs）和全氟及多氟烷基物质（PFAS）是两类高产量的化学物质，常见于空气、水、土壤、灰尘和人体血液中（Sahoo和Kumar，2023；Evich等人，2022；Nakayama等人，2019；You等人，2024）。流行病学研究表明，接触PAEs和PFAS会增加各种不良健康后果的风险，包括妊娠糖尿病、生殖系统功能障碍和肝脏损伤（Kahn等人，2020；Shaffer等人，2019；Weng等人，2023；Chen等人，2024；Yu等人，2021；Costello等人，2022）。从机制上看，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路可能是这两种化学物质的共同作用靶点。早期研究探讨了二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（DEHP）在肝脏中的作用机制和物种特异性效应，表明PPARα的激活及其后续的下游事件可能是DEHP诱导的啮齿动物肝癌发生的关键机制（Rusyn、Peters和Cunningham，2006）。最近使用人类肝细胞和脂肪细胞体外模型的研究表明，单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP）和单环己基邻苯二甲酸酯（MCHP）通过调节PPAR通路破坏葡萄糖和脂质稳态（Tian等人，2024；Shoaito等人，2019）。类似的研究也发现，PPAR的激活可能是PFAS体内效应的分子起始事件（Evans等人，2022；S?derstr?m等人，2022）。

值得注意的是，PPAR家族包含三种亚型——α、δ和γ，它们具有不同的代谢功能：PPARα增强细胞对脂肪酸的摄取、酯化和运输；PPARδ通过线粒体和去饱和途径驱动脂质和葡萄糖的氧化；PPARγ促进甘油三酯的合成和脂滴的储存（Yan和Horng，2020）。然而，大多数研究仅关注一种PPAR亚型，关于这两类化合物对不同PPAR亚型影响的系统比较研究尚缺乏。因此，PAEs和PFAS与PPAR信号通路相关的亚型特异性作用机制，以及主导其毒性作用的关键PPAR亚型仍不清楚。

巨噬细胞是先天免疫系统中重要的免疫细胞类型，有助于维持组织稳态。巨噬细胞的替代激活调节脂质和葡萄糖代谢，是维持组织代谢稳态的关键过程（Yan和Horng，2020；Xu和Lv，2023）。重要的是，巨噬细胞大量表达PPAR，这些受体是调节其替代激活和功能的关键（Chawla，2010；He等人，2021）。现有研究表明，包括PAEs和PFAS在内的环境污染物可以通过PPAR通路调节巨噬细胞的替代激活（Gao等人，2020；Wang等人，2024）。因此，巨噬细胞可能是这些物质引起组织毒性的靶细胞。然而，各个PPAR亚型在巨噬细胞替代激活中的具体作用仍不清楚。这一空白阻碍了对PAEs和PFAS毒理效应作用机制的阐明。

在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9系统在人类单核THP-1细胞系中建立了PPARα、PPARδ和PPARγ的亚型特异性敲除模型。这些模型细胞被暴露于PAEs和PFAS，以明确它们对白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）驱动的巨噬细胞替代激活的影响。结果使我们能够全面研究这两类物质在巨噬细胞中的作用机制，从而为理解这些化合物的不良健康效应提供了新的证据。

化学物质和试剂

单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP，CAS：4376–20–9）、单环己基邻苯二甲酸酯（MCHP，CAS：7517–36–4）、单异壬基邻苯二甲酸酯（MINP，CAS：106610–61–1）、单异丁基邻苯二甲酸酯（MIBP，CAS：30833–53–5）、单苯基邻苯二甲酸酯（MBzP，CAS：2528–16–7）购自AccuStandard（美国纽黑文），纯度>99%；全氟十一烷酸（PFUnDA，CAS：2058–94–8）和全氟癸酸（PFDA，CAS：335–76–2）购自Aladdin（中国上海），纯度>97%。

基于THP-1细胞建立PPAR亚型敲除模型

在本研究中，使用CRISPR/Cas9系统分别在THP-1细胞中建立了PPARα、PPARδ和PPARγ的特异性敲除。Sanger测序结果显示，与野生型细胞相比，每个细胞系的sgRNA靶结合位点都观察到了大片段缺失，证实了敲除的有效性（图1B）。

PPAR亚型对巨噬细胞替代激活和CD36表达的影响

高内涵荧光成像和定量分析显示，在替代激活的巨噬细胞（Act）中，CD209和CD36蛋白水平的变化...

讨论

利用CRISPR/Cas9系统，本研究首次生成了PPARα、δ和γ单敲除的THP-1巨噬细胞模型，发现IL-4/IL-13诱导的CD209相对表达在PPARδ缺失时被消除，在PPARα缺失时减弱，在PPARγ缺失时增强，从而确定PPARδ是必需的，PPARα是巨噬细胞替代激活的正调节因子，而PPARγ是负调节因子。PAE代谢物和PFAS均以剂量依赖的方式抑制CD209并调节CD36的表达。

结论

本研究确定了PPARα、PPARδ和PPARγ在调节人类巨噬细胞替代激活中的亚型特异性作用。PAEs和PFAS通过不同的PPAR亚型特征干扰巨噬细胞的替代激活。这些发现为研究环境污染物相关的PPAR信号通路作用机制提供了新的工具和分子标志。

作者贡献声明

田亚茹：实验研究。李永宁：方法学。志远：软件、方法学。庄志森：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、实验研究。游丽娟：方法学。孔建波：软件、方法学。张波：资源获取、方法学。万毅：方法学、实验研究、概念构思。贾旭东：资源获取、项目管理、资金申请。杨慧：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（批准号：82373625和22225601）和广东省自然科学基金（批准号：2025A1515012731）的支持。

附录A. 支持信息

1) PAEs和PFAS处理后替代激活巨噬细胞的细胞活力评估。2) PPAR亚型敲除对巨噬细胞中CD209和CD36表达的影响。3) PAEs和PFAS对CD36表达的定量分析。4) BMDL₁₀的估算...