SPARK-seq：一个用于适配体发现和动力学分析的高通量平台

《SCIENCE》：SPARK-seq: A high-throughput platform for aptamer discovery and kinetic profiling

SPARK-seq通过整合CRISPR基因干扰与单细胞多组学技术，实现aptamer筛选和动力学分析，发现慢解离aptamer对低丰度靶标的高特异性结合，并利用AI加速靶向诊断治疗工具设计。

　　

编辑总结

体外筛选可以产生能够形成复杂三维结构并识别特定目标分子的DNA或RNA序列。这些适配体被用于传感、结合和成像应用，甚至适用于像活细胞这样的复杂目标，其中被识别的分子种类并不一定已知。Luo等人开发了一种用于适配体目标识别的测序方法，以及一种用于适配体预测和设计的并行计算模型（参见Mayer的观点）。CRISPR介导的基因破坏会引发可与之关联的结合丧失现象，从而提供识别目标的信号。由此产生的高通量数据为生成式机器学习提供了基础，以设计优化的适配体序列。——Michael A. Funk

结构化摘要

引言

细胞表面蛋白是大多数临床可操作的目标，对细胞通信、信号传导和稳态至关重要。然而，针对这些目标生成高亲和力分子探针（如适配体）的方法仍然有限。目前的方法通量较低，且常常会破坏天然蛋白质的构象，导致大多数这些目标未被充分探索，从而阻碍了基于适配体的诊断和治疗开发。

研究背景

我们假设，结合CRISPR介导的基因扰动与单细胞多组学技术的多模式方法可以克服传统适配体筛选的局限性。通过在单个细胞内同时分析基因扰动、基因表达和蛋白质结合，我们建立了单细胞扰动驱动的适配体识别和动力学测序（SPARK-seq）平台，该平台能够在天然细胞环境中实现适配体-目标相互作用的高通量映射。这种集成设计不仅有助于识别低丰度目标的结合剂，还将发现过程与动力学分析直接结合起来，加速了精确分子工具的开发。

结果

我们应用SPARK-seq通过多重CRISPR敲除技术与单细胞mRNA及适配体测序相结合，系统地研究了适配体-目标相互作用。经过四轮Cell-SELEX（通过指数富集系统进化配体）富集后，将适配体库与经过CRISPR敲除13种表面蛋白的细胞群体进行了筛选。单细胞测序能够同时检测gRNA、转录组和适配体结合事件，从而将基因扰动与适配体结合特征联系起来。

利用我们的计算流程——单细胞扰动-适配体识别和靶向适配体生成算法（SPARTA），我们分析了8466个高质量的单细胞样本，并将前10,000个独特的适配体序列聚类为1906个家族。差异结合分析识别出5535个针对8种不同表面蛋白的适配体序列。通过流式细胞术、表面等离子体共振和微尺度热泳的验证确认了目标的特异性和纳摩尔亲和力。该方法还解析了复杂的结合模式，包括一种识别ITGA3/ITGB1整合素的适配体以及一种能结合多个PTPR同源物的适配体。

SPARK-seq优先富集解离速率较慢的适配体（k_off）。在多个目标中，结合差异（?log2FC）与k_off有很强的相关性（R2 = 0.8至0.9），但与平衡亲和力（K_D）无关，这突显了该平台能够分离出与目标长时间结合的适配体的能力，这是治疗和诊断应用的关键特征。利用这些数据，SPARTA基于卷积神经网络的分类器在预测PTK7结合序列方面的准确率达到了约97%，其生成模块还产生了具有改进动力学特性的功能性变体。

结论

SPARK-seq是一个集成平台，结合了CRISPR介导的基因扰动、单细胞转录组学和基于序列的适配体分析，并通过SPARTA深度学习框架进行了增强。这项工作为“适配组学”奠定了基础，这是一种多组学支持的技术，用于大规模、基于测序的适配体结合特异性和目标属性解码。通过将数百万个适配体结合事件转化为与遗传和转录状态相关的高维测序数据，SPARK-seq能够在数千个单个细胞中实现基因型-表型-配体之间的直接映射。这种多模式策略扩展了检测低丰度和构象敏感目标的动态范围，在序列分辨率上解析了动力学和富集模式，并支持快速、可扩展的高特异性适配体发现和合理优化，为先进的诊断和治疗应用铺平了道路。

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用于适配体发现和变体设计的Spark-seq。

基于CRISPR的Cell-SELEX工作流程通过对照细胞和敲除细胞之间的差异结合来识别适配体，随后通过单细胞测序进行大规模的适配体-目标相互作用分析。深度学习框架随后预测并设计出具有改进结合动力学的适配体变体。

摘要

细胞表面蛋白是关键的疾病生物标志物和治疗靶点，然而针对这些蛋白的原位高通量适配体发现方法仍然有限。我们引入了单细胞扰动驱动的适配体识别和动力学测序（SPARK-seq），这是一个将单细胞信使RNA和适配体测序与CRISPR介导的表面蛋白扰动相结合的高通量平台。在单次实验中，SPARK-seq同时将5535个不同的适配体映射到8种表面蛋白上，涵盖了超过两个数量级的蛋白质丰度差异和多种生物物理类别。该方法能够区分密切相关的同源蛋白，且没有可检测的交叉反应，并提供了动力学信息，从而优先选择了解离速率较慢的适配体。利用这种动力学多样性，我们设计了具有改进解离特性的适配体变体。SPARK-seq为高效发现和合理设计适配体及功能性核酸建立了平台，为诊断和治疗领域打开了新的可能性。