《Ophthalmic Genetics》：IMPG2-associated retinal dystrophy with a novel missense variant and therapeutic options via adenine base editing
ABSTRACT
本研究描述了一例早发性视杆-视锥细胞营养不良伴中央黄斑萎缩患者中发现的IMPG2基因新型错义变异，并评估了腺嘌呤碱基编辑（ABE）作为治疗策略的潜力。眼科评估包括超广角眼底照相、眼底自发荧光和光谱域光学相干断层扫描。基因检测采用靶向下一代测序panel并进行桑格测序验证。通过计算机预测工具、蛋白稳定性算法和结构建模评估了变异的致病性。通过PAM位点识别和向导RNA设计分析了ABE的可行性。
遗传测试结果显示患者复合杂合了一个致病性无义变异（c.411G>A; p.Trp137*）和一个位于SEA-1结构域内的新型错义变异（c.871C>A; p.Arg291Ser）。虽然计算机预测工具将p.Arg291Ser分类为良性或中性，但结构建模和稳定性分析支持其具有去稳定化效应。碱基编辑评估表明c.411G>A可通过ABE进行靶向纠正。本病例强调了IMPG2基因结构域特异性变异的临床相关性以及计算机预测的局限性。ABE为IMPG2相关视网膜病变提供了一个有前景的治疗选择。
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引言
光感受器间基质蛋白聚糖-2（IMPG2，OMIM 607056）编码一种1241个氨基酸的蛋白聚糖（约138.5 kDa），也称为IPM200或SPACRCAN。该蛋白包含一个信号肽、两个SEA（海胆精子蛋白、肠激酶、聚集蛋白）结构域、两个EGF样结构域、一个跨膜区和一个胞质尾区。它由光感受器合成并分泌到光感受器间基质中，参与视网膜结构、粘附和光感受器功能。
IMPG2的致病性变异与一系列视网膜疾病相关，包括常染色体隐性（AR）早发性伴黄斑受累的视杆-视锥细胞营养不良、常染色体显性（AD）成人发病的卵黄样黄斑营养不良（AVMD）、杂合携带者的单侧卵黄样病变以及类Stargardt青少年黄斑病变。
目前尚无批准用于IMPG2相关视网膜病变的治疗方法。虽然基因替代疗法对几种AR视网膜营养不良有效，但其在IMPG2上的应用受限于该基因的大尺寸。CRISPR DNA碱基编辑已成为一种有前景的替代方案，它能够不可逆地纠正所有转换变异，且不引入双链DNA断裂。这种方法提高了体内安全性，特别适用于靶向光感受器等有丝分裂后细胞。
碱基编辑器由催化活性受损的CRISPR核酸内切酶（切口酶）与核苷特异性脱氨酶融合而成，通过gRNA引导至靶位点。最常用的碱基编辑器包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。CBE将C转换为T，而ABE将A转换为G，当合适的原型间隔子相邻基序（PAM）序列将变异置于编辑窗口内时，可实现精确的单碱基校正。
我们报告一例早发性视杆-视锥细胞营养不良伴中央黄斑萎缩的男性患者，该患者在过去9年间于我们的三级转诊中心接受纵向随访。患者目前72岁，在二十岁出头时出现夜盲症，随后数十年视力缓慢进行性下降。在最近一次评估中，其最佳矫正视力为双眼指数，这一水平在整个随访期间基本保持稳定。
眼底检查显示周边骨细胞样色素沉着、视网膜血管变细以及中央黄斑萎缩伴中心凹周围区域部分保留。在九年随访期间重复进行的多模态成像——包括超广角眼底照相、眼底自发荧光和SD-OCT——显示视网膜结构改变无明显进展。
基因检测显示IMPG2基因存在复合杂合变异：一个已知的致病性无义变异（c.411G>A; p.Trp137*）和一个位于SEA-1结构域保守基序内的新型错义变异（c.871C>A; p.Arg291Ser）。
考虑到患者就诊时年龄较大且表型已完全确立，未进行全视野视网膜电图或Goldmann视野检查。
鉴于该基因与腺相关病毒（AAV）载体为基础的基因增强方法不兼容，我们进一步研究了ABE作为潜在治疗策略的可行性。
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材料与方法
患者在牛津眼科医院接受了全面的眼科评估。临床数据和基因检测作为常规临床护理的一部分获得，所有信息均为回顾性收集。所有程序均遵循《赫尔辛基宣言》的伦理标准和当地机构审查委员会的指导方针。获得了患者关于发布临床数据和视网膜图像的书面知情同意。视网膜成像包括使用Optomap P200系统的伪彩色超广角眼底照相和眼底自发荧光（FAF），以及使用Spectralis平台进行的SD-OCT。
获得了患者DNA血样的知情同意，样本被送往牛津区域遗传学实验室。使用定制的HaloPlex靶向富集系统扩增目标基因的编码区和内含子/外显子边界（±10 bp），最后在威康信托人类遗传学中心的高通量基因组学组使用Illumina MiSeq仪器进行测序。对111个与RP和RP样表型相关的基因进行了分子分析。检测到的变异通过桑格测序确认。
使用成熟的计算机工具评估变异致病性，包括SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN和MutationTaster，这些工具评估进化保守性并预测氨基酸替换的功能影响。
使用DynaMut2、mCSM、I-Mutant3.0和MuPRO评估p.Arg291Ser替换对IMPG2蛋白稳定性的影响。这些工具基于序列和/或结构特征预测变异诱导的稳定性变化（ΔΔG）；负ΔΔG值表明去稳定化。由于IMPG2的结构尚未通过实验确定，我们使用了通过AlphaFold2算法生成并由AlphaFold数据库提供的IMPG2模型。使用PyMOL生成原子分子可视化图。为了获得其他含SEA结构域蛋白的解析结构，我们使用相关搜索词查询UniProt和蛋白质数据库（PDB），并手动筛选出在单条链上编码的真正SEA结构域。
为了评估已识别可能致病变异的可编辑性，首先根据变异类型分析其是否适合碱基编辑。然后，分析变异周围的序列，寻找可用的PAM位点，以便将目标核苷酸置于SpCas9-ABE8e、SaCas9-ABE8e、KKH-SaCas9-ABE8e或CasMini-ABE8e（最常用的碱基编辑构建体）的编辑窗口内，并使用Benchling软件相应设计向导RNA。最后，分析这些向导RNA引入不必要旁观者编辑的可能性，并使用PolyPhen-2预测其致病性。所有分析均使用GRCh37/h19基因组版本和IMPG2转录本ENST00000193391。
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结果
眼科评估揭示了视杆-视锥细胞营养不良表型，伴有中周部骨细胞样色素沉积、视网膜血管变细以及被中心凹周围保留环包围的中央黄斑萎缩。FAF显示中心凹和视盘周围自发荧光减弱，中心黄斑周围环绕着高自发荧光环，中周部存在广泛的融合性低自发荧光病灶。SD-OCT显示中心凹和视盘周围外层视网膜萎缩及椭球体带破坏，而中央黄斑以外的视网膜色素上皮相对保留。
下一代测序鉴定出IMPG2基因存在复合杂合变异。c.411G>A变异导致提前终止密码子（p.Trp137*），是一个已知的致病性变异。第二个变异c.871C>A（p.Arg291Ser）是一个新型错义变异。由于父母均已去世且患者的姐姐拒绝进行基因检测，无法进行分离分析。
使用多种计算机预测工具评估p.Arg291Ser变异。SIFT预测该替换为耐受（评分：0.09；阈值<0.05），而PROVEAN将其分类为中性（评分：-2.409；临界值=-2.5）。PolyPhen-2返回良性预测（评分：0.242），MutationTaster以高置信度（概率：0.9999998）将该变异识别为多态性。
我们首先从AlphaFold数据库获取了IMPG2的3D结构模型，因为目前尚无IMPG2的实验解析结构。序列的某些区域结构未定义，这可能与内在无序性有关，或反映了AlphaFold2训练集中类似序列数据的缺乏。然而，包括含有p.Arg291的SEA结构域在内的几个结构域似乎建模良好，具有高或极佳的预测局部距离差异测试（pLDDT）置信度评分。p.Arg291周围的区域建模尤其可信，pLDDT评分≥0.88。
随后，我们使用多个考虑结构和序列的独立预测工具评估了p.Arg291Ser替换对IMPG2蛋白稳定性的影响。DynaMut2基于与p.Glu289的盐桥丢失和与p.Thr312的氢键丢失，预测了去稳定化变化（ΔΔG = -1.02 kcal/mol），表明突变蛋白的热力学稳定性降低。在该位置的所有单点变异中，Ser291的稳定性排名位于后四分之一。类似地，mCSM得出ΔΔG为-1.276 kcal/mol，支持去稳定化效应。I-Mutant2.0也预测在生理条件下（pH 7.0，25°C）稳定性降低，具有高可靠性指数（RI=8）。MuPRO进一步预测了去稳定化效应（ΔΔG = -1.11 kcal/mol），SVM（置信度评分：-0.95）和基于神经网络的分析（-0.99）均证实了这一点。
最后，我们还探索了PDB中可用的已解析单体SEA结构域结构。我们的分析揭示了一个反复出现的基序，即链2上的一个精氨酸残基在链2和链3之间形成协调的极性相互作用，补充了骨架氢键网络。尽管位于链2的不同位置，但在所有β-片层链在单条多肽链内编码的三个已解析结构中均观察到了这种相互作用基序。这种保守相互作用在已解析结构中的存在，增强了对IMPG2模型中p.Arg291周围侧链预测的信心，并表明由精氨酸介导的辅助稳定网络可能起关键作用。它可能通过促进链3与链2的稳健堆积来辅助折叠，从而促进该单元随后组装到链1上，或者直接有助于常规完全折叠蛋白的功能。
在基因检测中识别出的两个可能致病变异中，已知的致病性无义变异（c.411G>A; p.Trp137*）作为G-to-A转换单核苷酸变异（SNV），理论上可以通过腺嘌呤碱基编辑器纠正，因此相应地评估了合适PAM位点的可用性。结果发现，有一个可用于SpCas9-ABE8e的PAM位点，两个可用于SaCas9-ABE8e和KKH-SaCas9-ABE8e的PAM位点，并据此设计了向导RNA。为了评估这些旁观者编辑的可能致病性，使用PolyPhen-2分析了引入的错义变化，表明p.(Tyr136Cys)可能具有破坏性（评分0.985，满分1.000），p.(Asn139Gly)可能具有破坏性（评分0.712），而其他氨基酸变化预测为良性：p.(Met138Val)评分0.068，p.(Asn139Asp)评分0.006，p.(Asn139Ser)评分0.024。在所测试的设计中，SpCas9-ABE8e成为最合适的构建体，因为它仅引入单个良性旁观者编辑（p.Met138Val），而基于SaCas9的编辑器产生了额外的预测可能具有破坏性的旁观者替换。
患者的另一个变异c.871C>A, p.(Arg291Ser)作为C-to-A颠换SNV，无法用当前的碱基编辑器纠正，因为它们不能引入A-to-C编辑。然而，另一种称为 prime editing (PE) 的CRISPR基因编辑方法可能适用于新疗法开发，因为PE可以纠正所有SNV以及许多小的插入缺失。此外，纠正c.411G>A无义变异可能提供治疗益处，因为患者携带与隐性IMPG2疾病一致的双等位基因致病性变异，恢复一个功能性等位基因可能就足够了。
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讨论
先前研究表明，IMPG2的单等位基因变异通常与卵黄样黄斑病变相关，而双等位基因变异会导致更严重的表型，例如早发性黄斑萎缩的视杆-视锥细胞营养不良。
我们的患者被发现携带一个已知的致病性无义变异（c.411G>A; p.Trp137*）和一个新型错义变异（c.871C>A; p.Arg291Ser），该变异影响IMPG2 SEA-1结构域内一个高度保守的残基。
与先前报道的复合杂合病例一致，该患者表现出相对早期的中心凹萎缩，这与周边视网膜变性的程度似乎不成比例。这一发现支持了越来越多的证据，表明即使IMPG2的复合杂合变异也可能导致显著的结构和功能破坏，特别是当位于功能关键结构域时。
值得注意的是，该新型变异位于SEA-1结构域内，这是一个进化上保守的区域，已知对蛋白水解加工、蛋白分泌和光感受器间基质内的定位很重要。IMPG2包含两个SEA结构域：SEA-1（非蛋白水解性）和SEA-2（蛋白水解性）。影响这些结构域的变异在视网膜疾病中已有充分记载。
SEA-1结构域内的几个错义、无义和剪接变异——包括p.(Ala243Pro)、p.(Leu249Phe)、p.(Glu272)、p.(Glu276)、c.828+1G>A、c.828+1961_908+1073del、c.829-1G>T、p.(Arg296_Asp302del)、c.909-802_1154-539del、p.(Gly304Asp)和p.(Tyr349Ilefs*)——已被分类为致病性或可能致病性，并与AR视杆-视锥细胞营养不良或AVMD相关。这些背景证据强烈支持p.Arg291Ser变异可能引起类似功能破坏的假设。
然而，计算机预测工具（如PolyPhen-2、SIFT和CADD）返回了相互矛盾但总体良性的结果，导致根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南将p.Arg291Ser分类为意义不明确的变异（VUS）。
但是，常用的错义致病性预测因子（如SIFT、PolyPhen-2、CADD）并不总能捕捉到结构域特异性结构破坏的功能后果。IMPG1，一种旁系同源蛋白聚糖，说明了这一局限性。IMPG1 p.Leu740Phe变异最初被计算工具预测为“可能良性”，但随后的生化分析揭示了显著的物理化学扰动，包括改变的分子量、等电点和稳定性指数。
类似地，同义变异也可能被错误分类为良性。例如，CDHR1 c.783G>A变异（rs147346345）不改变氨基酸序列，因其在人群数据库中相对较高的次要等位基因频率（0.31%）和纯合个体出现而被计算机预测所忽略。然而，患者来源的RNA分析显示，它诱导了第8外显子跳跃，导致框内缺失，破坏了CDHR1蛋白的关键胞外结构域，并导致中心性晕轮状脉络膜营养不良。
在p.Arg291Ser的案例中，多条替代证据线索提示功能破坏。确实，患者表现为早发性伴黄斑受累的视杆-视锥细胞营养不良，这与AR IMPG2相关视网膜病变的严重表型谱一致。此外，Arg291位于结构关键的SEA-1结构域内，该区域先前已描述过其他几个致病的错义变异。IMPG2的SEA-1结构域位于预测的粘蛋白样序列内，该序列在蛋白质的正确糖基化和细胞运输中起作用。值得注意的是，SEA-1包含两个N-连接糖基化位点，破坏该结构域可能会损害IMPG2向细胞膜的靶向，最终影响其在光感受器间基质内的功能。此外，精氨酸和丝氨酸残基的大小显著不同，并且具有不同的化学性质，在结构中的相同相对位置上可能不兼容。在此，我们展示了所有四个基于结构和序列的独立稳定性预测工具均表明p.Arg291Ser替换对IMPG2蛋白SEA-1结构域具有去稳定化影响。单体SEA结构域中链2上精氨酸与链3上极性/带电残基之间基序的进化保守性表明链2精氨酸在成功分子组装中起作用。然而，我们注意到R291可能对IMPG2有其他关键的功能贡献，这些无法通过单独的结构建模检测到。
鉴于表型的严重性以及与IMPG2相关的视网膜营养不良谱系，开发靶向治疗策略日益迫切。鉴于IMPG2的大编码序列与传统AAV介导的基因增强策略不兼容，ABE作为等位基因特异性纠正的一种有前景的治疗替代方案脱颖而出。使用靶向前链的ABE，理论上可以进行精确的DNA编辑，将c.411G>A无义变异恢复为野生型序列，从而恢复全长IMPG2蛋白。在该区域识别出了适用于SpCas9-ABE8e、SaCas9-ABE8e和KKH-SaCas9-ABE8e的合适PAM位点，其中SpCas9-ABE8e构建体可能仅引入单个旁观者编辑（p.Met138Val），该变化预测在结构上是可耐受的。
由于该患者的IMPG2相关视网膜病变最可能以AR方式遗传，仅纠正无义变异预期即可带来治疗益处。对于c.871C>A（p.Arg291Ser）变异，用当前的ABE系统恢复为野生型密码子不可行；然而，编辑可能产生替代的氨基酸替换，其结构和功能后果需要进一步研究。
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结论
本病例阐释了在遗传性视网膜疾病中解读VUS的复杂性。尽管计算机预测工具将新型IMPG2错义变异（p.Arg291Ser）分类为良性或中性，但结构建模和蛋白稳定性分析表明其在SEA-1结构域内具有去稳定化效应，支持其致病潜力。结合患者的早发性黄斑萎缩型视杆-视锥细胞营养不良表型，这些发现扩展了IMPG2相关视网膜病变的谱系，并强调了计算机预测在孤立使用时的局限性。
在治疗方面，IMPG2的大尺寸排除了传统的AAV介导的基因增强。相比之下，ABE提供了一种有前景的等位基因特异性纠正策略，特别是对于无义转换变异（c.411G>A; p.Trp137*），该变异理论上可用现有的ABE系统靶向。
缺乏分离分析、功能验证实验以及治疗建模的探索性性质是本研究的局限性。尽管如此，临床、结构和分子数据的整合为变异解读提供了稳健的框架，并指向基因组编辑技术作为IMPG2相关视网膜病变的未来治疗途径。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。
