《SCIENCE ADVANCES》：Targeting transthyretin by one Cas9 variant with superfidelity and broad compatibility
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本研究针对CRISPR-Cas9系统在治疗转甲状腺素蛋白（TTR）基因相关ATTR淀粉样变性中存在脱靶编辑和染色体易位等安全性问题，通过结构分析理性设计了一系列SpCas9变体。研究发现SpCas9-Mut5在保持高效靶向编辑TTR基因的同时，展现出极低的脱靶活性和染色体易位率，并能与腺嘌呤碱基编辑器（ABE）系统兼容，显著提升编辑保真性并缩窄编辑窗口，为多种疾病的精准基因治疗提供了安全高效的新工具。
转甲状腺素蛋白（Transthyretin, TTR）在人体内主要负责运输甲状腺激素和维生素A。然而，当TTR蛋白发生错误折叠并沉积在心脏、神经等组织中时，会引发一种致命的疾病——ATTR淀粉样变性。这种疾病可分为由野生型TTR引起的获得性ATTR（ATTRwt）和由TTR基因突变导致的遗传性ATTR（hATTR）淀粉样变性，影响着全球数十万人的健康，患者生存期在出现症状后显著缩短。传统的治疗方法，如稳定TTR蛋白四聚体结构的小分子药物（如Vyndamax）或利用小干扰RNA（siRNA）及反义寡核苷酸（ASO）技术来抑制TTR合成，虽然能缓解症状，但大多需要长期乃至终身用药，给患者带来不小的负担。
近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术为一次性根治遗传性疾病带来了曙光。其中，来自化脓链球菌的Cas9（SpCas9）蛋白应用最为广泛。基于此技术的在体基因编辑疗法NTLA-2001已在临床试验中显示出能大幅降低TTR蛋白水平。然而，SpCas9就像一把不够精确的“基因剪刀”，在切割目标基因的同时，也可能误伤基因组的其他位置，即产生“脱靶编辑”。更令人担忧的是，其造成的DNA双链断裂（DSB）可能导致染色体易位，严重威胁基因组完整性。尽管已有一些高保真变体如SpCas9-HF1、SpCas9-HF4和HiFi Cas9被开发出来，但它们在进行TTR基因编辑时的效率和安全性仍需全面评估。为了解决这些安全性瓶颈，推动高保真CRISPR-Cas9技术的临床转化，研究人员开展了这项系统性研究，相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。
为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法：利用体外转录（IVT）合成编码野生型（WT）及各种变体SpCas9的mRNA；设计并化学合成靶向TTR等基因的单向导RNA（sgRNA）；采用不同的脂质纳米粒（LNP）配方（如LNP-01）用于体内外递送mRNA和sgRNA；通过T7内切酶I（T7E1） assay、Western blot、酶联免疫吸附试验（ELISA）和扩增子测序（amplicon-seq）评估基因编辑效率和蛋白敲低效果；利用GUIDE-seq技术进行全基因组范围的脱靶效应分析；采用引物延伸介导的测序（PEM-seq）检测染色体易位事件；在TTR人源化小鼠模型和食蟹猴模型中评估体内编辑效果和安全性；将SpCas9-Mut5与腺嘌呤碱基编辑器ABE8e融合，构建ABE8e-mut5，并分析其编辑保真性和编辑窗口。
CRISPR-Cas9系统可靶向TTR基因内的多个位点
研究人员首先验证了CRISPR-Cas9系统敲低TTR基因的能力。他们合成了高纯度的WT SpCas9 mRNA，并设计了5条靶向TTR基因不同区域的sgRNA（sgTTR-1至sgTTR-5）。实验证明，所有这些sgRNA都能引导WT SpCas9在HEK293T细胞中有效编辑TTR基因。其中，sgTTR-1、sgTTR-2和sgTTR-3引导的编辑能显著降低HepG2细胞分泌的TTR蛋白水平。然而，生物信息学预测提示sgTTR-3可能导致大量脱靶编辑，因此后续研究主要聚焦于sgTTR-1和sgTTR-2。研究还发现，WT SpCas9以及已报道的高保真变体SpCas9-HF1和SpCas9-HF4在sgTTR-1引导下均能大幅降低TTR蛋白表达，但编辑效率存在差异。
CRISPR-Cas9编辑诱导全基因组范围的脱靶突变
利用GUIDE-seq技术进行全基因组脱靶分析发现，将WT SpCas9与sgTTR-1以1:1质量比共转染HepG2细胞后，除了18号染色体上的靶位点，还在其他多条染色体上检测到脱靶突变。相比之下，sgTTR-1诱导的脱靶位点数量远少于sgTTR-2，表明sgTTR-1是更安全的sgRNA选择。
LNP组成影响基因编辑效率
为了优化体内递送，研究人员在TTR人源化小鼠模型中测试了四种不同的LNP配方（LNP-01至LNP-04）。结果显示，LNP-01在降低血清TTR蛋白水平和编辑肝脏TTR基因方面表现最佳且可重复。进一步优化LNP-01中sgTTR-1与SpCas9-HF1 mRNA的质量比发现，当比例为1:1时，基因编辑效率和TTR蛋白敲低效果达到最优。
SpCas9-HF1的保真性受sgTTR-1与mRNA比例的影响
即使在优化的1:1质量比条件下，SpCas9-HF1仍会在HepG2细胞中引起11个脱靶编辑，脱靶编辑频率（脱靶编辑与靶向编辑的比值）为0.04。当sgTTR-1与mRNA比例调整为1:4时，脱靶位点增至28个，脱靶频率升高至0.17。这表明即使是高保真变体，其保真性也会受到实验条件的影响，且脱靶风险依然存在。
理性设计SpCas9变体
为了进一步提升SpCas9的保真性，研究人员对SpCas9-sgRNA-靶DNA复合物结构（PDB_ID: 5FW3）进行了分析，发现除了已知的关键残基外，Lys526、Asn692、His698、Arg895和Arg919等残基的侧链也靠近sgRNA或靶DNA的骨架，可能参与非特异性相互作用。基于此，他们理性设计了六个新型SpCas9变体（Mut1-Mut6），每个变体包含不同数量的丙氨酸（Ala）取代。T7E1实验证实所有这些新变体均具有TTR基因编辑功能。
SpCas9-Mut5是一种超保真变体
在TTR人源化小鼠模型中评估这六个新变体的体内编辑效率，发现它们均能有效降低血清TTR蛋白水平，其中Mut5的敲低效果（93.4%）与WT SpCas9（91.6%）相当，表明引入的突变并未显著损害其靶向编辑活性。关键的GUIDE-seq脱靶分析显示，SpCas9-Mut5仅诱导了6个脱靶编辑位点，且均位于内含子或基因间区，其整体脱靶编辑频率（0.014）远低于WT SpCas9（0.894），也显著低于SpCas9-HF1（0.045），证明SpCas9-Mut5是一种超保真变体。
SpCas9-Mut5具有长期敲低能力
单次给予TTR人源化小鼠1 mpk剂量的装载有sgTTR-1和SpCas9-Mut5 mRNA的LNP-01后，血清TTR蛋白水平在给药后第4天即下降约90%，并且这种敲低效果可持续至少168天（超过24周），证明了其持久的治疗效果。
SpCas9-Mut5可有效编辑食蟹猴的TTR基因
在食蟹猴原代肝细胞（PMHs）中，使用针对食蟹猴TTR基因设计的sgRNA（sgTTR-6），SpCas9-Mut5在32 nM浓度下实现了约89%的编辑效率，与WT SpCas9效果相当。在食蟹猴体内实验中，单次静脉输注3 mpk剂量的LNP-01（装载sgTTR-6和SpCas9-Mut5 mRNA）后，血清TTR水平在第4天下降约45%，并在第21天进一步下降至65-70%，证实了SpCas9-Mut5在非人灵长类动物模型中的有效性。
SpCas9-Mut5可高效编辑多个人类基因
为了验证SpCas9-Mut5的普适性，研究人员测试了其编辑其他疾病相关基因（如TRAC、ZC3H12A、VEGFA和EMX1）的能力。扩增子测序结果表明，SpCas9-Mut5在多数位点展示了与WT SpCas9相当甚至更优的靶向编辑效率，同时在这些位点已知的潜在脱靶位点上，其脱靶活性显著低于WT SpCas9，进一步证实了其高保真性和广泛适用性。
SpCas9-Mut5展现出更优的基因编辑安全性
通过PEM-seq技术分析染色体易位事件发现，WT SpCas9编辑TTR基因后，易位率高达1.33%，且前五位的高频易位均发生在靶位点与已识别的脱靶位点之间。相比之下，SpCas9-Mut5编辑后的易位率降至0.71%，且仅检测到一例靶位点与脱靶位点之间的易位，显著改善了基因组编辑的安全性。
SpCas9-Mut5提升了ABE的保真性
研究人员将SpCas9-Mut5与ABE8e系统融合，构建了ABE8e-mut5碱基编辑器。在HEK293T细胞中，ABE8e-mut5在TTR、VEGFA、EMX1等多个基因位点保持了高效的靶向腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的转换活性，但在相应的脱靶位点上，其编辑效率显著低于ABE8e，表明SpCas9-Mut5的引入大幅增强了ABE系统的保真性。
SpCas9-Mut5缩窄了ABE的编辑窗口
对ABE8e-mut5和ABE8e在多个靶位点（如EMX1、HEK293T-2、F-site、ATGg2）的编辑窗口进行分析发现，ABE8e-mut5主要高效编辑位于Protospacer第4至第8位的腺嘌呤（A4-A8），而对于更远位置的腺嘌呤（如A2, A3, A9-A14），其编辑效率则大幅降低。这与ABE8e宽泛的编辑窗口（可编辑A2-A14）形成鲜明对比，意味着ABE8e-mut5能有效减少 bystander（旁观者）突变，实现更精准的碱基编辑。
本研究通过系统性实验证实，新开发的SpCas9变体SpCas9-Mut5是一种兼具高效靶向编辑能力和超低保真性的基因编辑工具。它不仅能够安全、长效地敲低TTR基因以治疗ATTR淀粉样变性，还展现出编辑多种疾病相关基因的潜力。更重要的是，SpCas9-Mut5能够与ABE系统完美兼容，衍生出的ABE8e-mut5编辑器在保持高效碱基转换能力的同时，显著降低了脱靶编辑风险并缩窄了编辑窗口，从而极大提升了碱基编辑的安全性。这项研究不仅为ATTR淀粉样变性的治疗提供了更优的候选方案，也为其他遗传性疾病的精准基因治疗奠定了坚实的基础，是基因编辑技术向临床安全转化的重要进展。未来，探索将SpCas9-Mut5与其他高保真变体的突变组合，以及将其应用于胞嘧啶碱基编辑器（CBE）中，有望进一步推动基因编辑工具的发展。
