《Developmental Biology》：Gsx2 Regulates Oligodendrocyte Precursor Formation in the Zebrafish Spinal Cord
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脊椎动物中枢神经系统中少突胶质细胞（OLs）的发育依赖神经前体细胞（NPCs）向少突胶质细胞前体（OPCs）的定向分化。本研究以斑马鱼为模型，通过单细胞RNA测序和单核细胞ATAC测序，发现pMN域NPCs中存在前OPCs亚群，其特异性表达Gsx2等少突胶质细胞相关转录因子。利用CRISPR/Cas9敲除gsx2基因，发现突变体胚胎在40 hpf时提前启动OPC分化，并产生过量OPCs，但髓鞘形成过程未受影响。多组学数据构建了以Gsx2为核心的调控网络，提示Gsx2通过时空调控机制参与OPCs分化的定时过程。
金伯利·A·阿雷纳（Kimberly A. Arena）|克里斯蒂娜·A·科尔恩斯（Christina A. Kearns）|穆罕默德·艾哈迈德（Mohamoud Ahmed）|丽贝卡·奥罗克（Rebecca O’Rourke）|查尔斯·G·萨格斯特伦（Charles G. Sagerstr?m）|桑托斯·J·弗兰科（Santos J. Franco）|布鲁斯·阿佩尔（Bruce Appel）
美国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多大学安舒茨分校（University of Colorado Anschutz）儿科系发育生物学部门，邮编80045
摘要
神经系统的发育依赖于神经前体细胞（NPCs）有序且协调地分化为多种神经元和胶质细胞。在脊髓中，pMN区域的NPCs在发育早期会产生神经元，随后产生少突胶质细胞前体细胞（OPCs），这些前体细胞会进一步分化为少突胶质细胞（OLs），即中枢神经系统的髓鞘形成细胞。目前尚不清楚哪些机制决定了神经前体细胞会走向少突胶质细胞的分化路径。我们以斑马鱼为实验模型，通过单细胞RNA测序和单核ATAC测序技术发现了一类名为pre-OPCs的NPC亚群，这类细胞似乎注定会分化为OPCs。pre-OPCs特异性表达多种编码少突胶质细胞特异性转录因子的基因，其中包括Gsx2，该基因在小鼠前脑中调控OPCs的形成。为研究Gsx2在斑马鱼OPCs分化中的作用，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了gsx2的功能缺失突变体。gsx2纯合突变体胚胎会提前开始OPCs的形成，并产生过多的OPCs，但不会影响OLs的分化。通过我们的单核多组学数据集，我们预测了一个以gsx2为中心的基因调控网络，并识别出可能受Gsx2转录调控的基因。综合这些研究结果表明，pre-OPCs中的Gsx2表达参与了OPCs分化的时间调控过程。
章节摘录
引言
在脊椎动物的中枢神经系统中（CNS），轴突被一种富含脂质的特殊膜——髓鞘所包裹，这种膜由称为少突胶质细胞的胶质细胞产生。髓鞘能够提高轴突中的电信号传导速度，并维持神经细胞的健康；因此，少突胶质细胞对脊椎动物的神经系统功能至关重要。要理解功能性神经回路在脊椎动物发育过程中的形成机制，就必须了解少突胶质细胞的生成过程。
结果
pre-OPCs是一类表达gsx2基因的神经前体细胞
在斑马鱼中，pMN前体细胞在受精后大约10至30小时开始产生运动神经元（Myers等人，1986年）（图1A）。OPCs的分化过程始于受精后约40小时（Scott等人，2021年），随后在受精后72小时分化为髓鞘形成细胞OLs（Buckley等人，2010年）（图1A）。在之前的命运追踪研究中，我们发现了...
讨论
尽管许多研究已经揭示了调控少突胶质细胞分化的机制（Emery和Wood，2024年），但我们对决定神经前体细胞走向少突胶质细胞命运的机制仍存在较大认知空白。这一空白主要是由于我们对产生OPCs的具体神经前体细胞及其分化调控基因的了解还不够全面。通过本研究和之前的研究...
斑马鱼品系与饲养
所有动物实验均获得了科罗拉多大学医学院机构动物护理和使用委员会（IAUCUC）的批准。所有非转基因胚胎均来自AB品系雄性和雌性的配对杂交。所有转基因胚胎则来自AB品系雄性或雌性与Tg(olig2:egfp)vu12品系雄性或雌性的配对杂交（Shin等人，2003年）。胚胎在含有6克Instant Ocean的卵水中于28.5°C的培养皿中培养。
免疫组化
幼虫在指定时间点用4%的PFA固定，室温下摇动3小时。然后用0.1%的Triton/1x PBS（PBSTx）冲洗，并在4°C下保存。随后将幼虫嵌入1.5%的琼脂/30%蔗糖溶液中过夜处理。冰冻后的组织块使用冷冻切片机切成15微米的横截面，并收集在偏振载玻片上。载玻片安装在Sequenza支架（Ted Pella cat 36105）上，用PBSTx冲洗3次，每次5分钟，然后用2%的山羊血清/2%的...CRediT作者贡献声明
查尔斯·G·萨格斯特伦（Charles G. Sagerstr?m）：撰写、审稿与编辑、资金申请。丽贝卡·奥罗克（Rebecca O’Rourke）：数据分析。穆罕默德·艾哈迈德（Mohamoud Ahmed）：实验研究。克里斯蒂娜·A·科尔恩斯（Christina A. Kearns）：实验研究、数据分析。布鲁斯·阿佩尔（Bruce Appel）：撰写、审稿与编辑、项目管理、资源协调、实验设计、概念构思。桑托斯·J·弗兰科（Santos J. Franco）：撰写、审稿与编辑、资金申请。金伯利·A·阿雷纳（Kimberly A. Arena）：初稿撰写、实验研究、资金申请、数据分析、概念构思。
关键资源表格
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|
| 抗体 |
| 抗兔Sox10抗体 | (Park等人，2005) | ZDB-ATB-081226-2 |
| 抗兔Sox2抗体 | Abcam | 97959 |
| 抗鼠Isl1抗体 | DSHB | 39.4-D |
| Alexa Fluor Goat Anti-Mouse 568抗体 | Life Technologies | A11004 |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rabbit 568抗体 | Life Technologies | A11011 |
| 化学物质、肽类及重组蛋白 |
|---|
| Protease Bacillus licheniformis | Sigma | P5380 |
| RNAScope Multiplex Fluorescent V2检测试剂盒 | ACD Bio | 323110 |
| RNAScope Probe-Dr-sox10-Ch-2 | ACD |
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）/国家神经疾病与中风研究所（R01 NS124166资助S.J.F.、B.H.A.和C.G.S.；R35 NS122191资助B.H.A.；以及Gates Frontiers基金会对B.H.A.的资助。我们感谢Tyler Gibson博士在生物信息学分析方面提供的技术支持，同时也感谢斑马鱼实验设施的工作人员在动物护理方面的辛勤工作。此外，还要感谢Kris Russell在建立gsx2突变体基因分型方案方面所做的贡献。
