昼夜节律钟基因cry1在斑马鱼（Danio rerio）幼体抗病毒反应调节中的作用

《Fish & Shellfish Immunology》：The role of the circadian clock gene cry1 in the regulation of the antiviral response in zebrafish ( Danio rerio) larvae

昼夜节律基因cry1a和cry1b在斑马鱼幼虫中不影响早期发育和生存，但突变导致异常行为、微生物群改变及抗病毒免疫缺陷，感染TiLV后存活率降低且病毒载量升高。

　　

米科拉伊·马祖尔（Mikolaj Mazur）|尼德哈桑·普拉纳昌德兰（Niedharsan Pooranachandran）|玛丽亚·扎维莎（Maria Zawisza）|扎内塔·巴拉恩（Zaneta Baran）|安娜·米哈利克（Anna Michalik）|米科拉伊·阿达梅克（Mikolaj Adamek）|玛格达莱娜·马尔钦科夫斯卡（Magdalena Marcinkowska）|温·苏拉切蓬（Win Surachetpong）|托马斯·K·普拉伊斯纳尔（Tomasz K. Prajsnar）|克日什托夫·拉库斯（Krzysztof Rakus）|卢卡什·皮亚诺夫斯基（Lukasz Pijanowski）|玛格达莱娜·查丁斯卡（Magdalena Chadzinska）

波兰克拉科夫雅盖隆大学（Jagiellonian University）生物学院动物学与生物医学研究所进化免疫学系，地址：Gronostajowa 9，邮编30-387

摘要：

所有生物都受到生物钟的影响。这一机制产生的节律影响着细胞活动、行为和免疫等生物过程。

在本研究中，我们探讨了斑马鱼幼体中生物钟基因cry1a和cry1b的功能，重点关注它们在早期发育、行为、微生物群组成和抗病毒免疫反应中的作用。通过使用CRISPR-Cas9基因编辑技术，我们生成了cry1a和cry1b基因发生靶向突变的斑马鱼品系，发现cry1基因对幼体的存活或发育并非必需。然而，这两种突变都导致了显著的行为变化，突变体幼体的运动活动比野生型（WT）幼体更为活跃。

微生物组分析显示，cry1a突变特别导致幼体微生物群中变形菌门（Proteobacteria）的数量增加。当受到蒂拉皮亚湖病毒（TiLV）感染时，cry1a和cry1b突变体的病毒载量均增加，存活率下降，表明其抗病毒反应受到削弱。具体而言，cry1a突变体在感染初期tlr22基因的表达较低，而cry1b突变体在感染后期抗病毒基因mxa的表达减少，这两者都降低了对TiLV的抵抗力。

总体而言，研究结果表明，尽管cry1a和cry1b突变不会显著影响早期发育，但这两个基因在调节斑马鱼幼体的行为、塑造微生物群以及调节先天抗病毒免疫方面发挥着重要作用。该研究突显了生物钟基因在脊椎动物生理和免疫中的多方面功能。

引言

在日常生活中，生物体暴露于多种外部因素中，包括光照、温度和季节性日照时间的变化。为了维持稳态并应对这些变化，生物体进化出了生物钟机制，该机制通过产生节律性周期来使生理过程与环境信号同步。核心生物钟蛋白（如BMAL1和CLOCK）形成转录激活复合物，驱动下游核心生物钟基因（包括Per和Cry）的表达。当PER和CRY蛋白积累到一定程度后，会通过负反馈机制抑制BMAL1和CLOCK的活性，从而维持24小时的振荡周期。此外，核受体REV-ERB和视黄酸相关孤儿受体A（RORA）进一步调节生物钟机制，其中RORA通过促进Bmal1的表达来增强生物钟节律的稳定性，而REV-ERB则抑制Bmal1的表达（Guillaumond等，2005；Partch等，2014；Liu等，2025；Mortimer等，2025）。

斑马鱼（Danio rerio）的生物钟机制已经得到充分研究，并在脊椎动物中高度保守（Cahill，2002）。由于硬骨鱼类特有的基因组复制，斑马鱼拥有丰富的生物钟基因，包括四个period基因（per1a、per1b、per2和per3）、七个cryptochrome基因（cry1a、cry1b、cry2、cry3a、cry3b、cry4和cry5）、三个bmal基因（bmal1a、bmal1b和bmal2clock基因（clocka和clockb）。这些核心生物钟基因通过负反馈回路调节自身的表达。值得注意的是，在斑马鱼中，cry1a和per2的表达可以直接由转录因子Tef诱导（Sacksteder和Kimmey，2022）。与哺乳动物不同，哺乳动物产生生物节律并同步外围生物钟的主时钟位于下丘脑的视交叉上核（SCN，Weaver，1998），而在斑马鱼中，这一功能似乎由松果体承担（Ben-Moshe等，2014）。然而，在鱼类中，生物钟系统高度分散，外围生物钟可以独立响应外部信号产生节律（Whitmore等，1998；Whitmore等，2000）。

研究表明，生物钟机制几乎存在于所有细胞中，并影响多种生理过程，包括微生物群和免疫系统。微生物群对肠道、胰腺甚至神经系统的正常发育至关重要（Xia等，2022）。生物钟与微生物群之间的相互作用是双向的，日常进食模式对维持微生物群稳定性至关重要（Zhao等，2022），而生物钟紊乱会导致微生物群组成的改变（Voigt等，2014）。

在免疫系统中，生物钟调节白细胞的数量、循环和活性（Cermakian等，2013）。例如，它调节自然杀伤细胞释放颗粒酶B和穿孔素（Arjona等，2004），免疫受体（如Toll样受体TLRs）和趋化因子受体的表达也遵循生物钟节律（Zeng等，2024）。此外，在鱼类中，许多免疫相关过程也表现出生物钟节律性。例如，在斑马鱼中，中性粒细胞的数量在光照中期达到峰值，而这些细胞产生的活性氧在光照后期最高。同样，参与大肠杆菌吞噬的吞噬细胞比例在光照后期达到峰值（Kaplan等，2008）。我们之前的研究表明，核心生物钟基因和蛋白在鲤鱼的淋巴器官和淋巴相关组织中也以生物钟方式表达，且这种表达依赖于光照条件（Mazur等，2025；Mazur等，2025）。这些发现清楚地表明，免疫系统与生物钟之间的相互作用在鱼类中同样重要且具有功能性。

我们最近的研究表明，在斑马鱼感染蒂拉皮亚湖病毒（TiLV）的成年模型中，病毒注射的时间影响了生物钟基因和抗病毒基因的表达以及病毒复制（Mazur等，2023）。我们还观察到鲤鱼的淋巴器官和组织中生物钟基因的持续表达，且在不同光照条件下表达模式会发生变化。此外，在感染鲤疱疹病毒3（CyHV-3）和鲤春病毒血症（SVCV）期间，淋巴组织中的生物钟基因表达水平与病毒拷贝数呈负相关（Mazur等，2025a）。

功能丧失研究也证明了生物钟与免疫系统相互作用的重要性。在斑马鱼幼体中，clock1a敲除增强了中性粒细胞向损伤部位的迁移（Chen等，2023），而per1b敲除在炎症模型中抑制了NF–κB信号通路（Ren等，2018）。需要强调的是，包括斑马鱼在内的鱼类的免疫反应与哺乳动物有许多相似之处。然而，斑马鱼的适应性免疫仅在受精后4-6周开始发育，这意味着早期幼体阶段可以专门研究先天免疫反应（Novoa和Figueras，2011）。在病毒感染过程中，多种斑马鱼细胞类型（包括吞噬细胞）通过病原体识别受体（如RIG-I样受体和TLRs）识别病毒核酸。这种识别激活信号级联反应，诱导I型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的表达。I型IFNs以自分泌和旁分泌方式进一步刺激抗病毒蛋白（如mxa）的表达（Langevin等，2013）。斑马鱼幼体和成体已被证明是研究病毒感染期间宿主-病原体相互作用的宝贵模型（Burgos等，2008；Palha等，2013；Sullivan等，2017）。最近，我们开发了斑马鱼的TiLV感染模型（Rakus等，2020）。TiLV由Eygnor等（2014）首次鉴定，是一种包膜负链单链RNA病毒，主要感染尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus），在水产养殖中导致高死亡率（Bacharach等，2016）。在斑马鱼中，TiLV感染会上调先天免疫基因的表达，包括rig-I和tlr-22、干扰素调节因子（irf3和irf7）、I型干扰素（inf?1）、抗病毒蛋白mxa和促炎细胞因子il-1β（Rakus等，2020；Mojzesz等，2021；Widziolek等，2021；Mazur等，2023）。

在本研究中，我们旨在探讨cry1a和cry1b基因敲除对斑马鱼幼体发育、行为和微生物群组成的影响。此外，我们还评估了这些敲除对TiLV感染后抗病毒免疫反应和幼体存活的影响。

选择cry1a和cry1b基因是基于它们作为斑马鱼生物钟核心组分的已知作用以及它们强烈的光诱导性。这些基因是光同步的主要介质，直接受光激活的转录因子调控，并且与其他生物钟基因相比表现出更强的节律性表达。重要的是，先前的研究和我们的数据表明，cry1a和cry1b不仅影响时间调节，还影响其他生理过程，包括调节抗病毒免疫反应。

动物

斑马鱼（图宾根品系，Danio rerio）在波兰克拉科夫雅盖隆大学动物学与生物医学研究所的斑马鱼核心设施中饲养和维护，该设施获得了克拉科夫地区兽医监察局和科学高等教育的许可（注册号022和0057）。鱼被饲养在独立的繁殖系统（Tecniplast，Buguggiate，VA，意大利）中，条件标准为水温28°C，光照周期14小时

cry1a和cry1b突变不会导致存活率降低或发育缺陷

对照组（cry1a^+/+，cry1b^+/+）和突变体（cry1a^-/-，cry1b^-/-）斑马鱼幼体的存活率被监测至10天龄。cry1a^+/+和cry1b^-/-幼体之间没有显著差异，两组存活率均高于97%（图1A）。相比之下，cry1b^-/-幼体的存活率略低于cry1b^+/+幼体，但两组总体存活率均超过75%（图1A）。存活率分析表明，cry1a和cry1b突变并未改变

讨论

在本研究中，我们探讨了cry1a或cry1b基因突变引起的生物钟功能障碍对斑马鱼幼体的影响，重点关注早期发育、存活、行为、微生物群组成以及针对TiLV的先天抗病毒免疫反应。我们的研究发现，cry1a和cry1b突变是稳定的遗传特征，不会降低存活率或影响幼体发育。因此，cry1a和cry1b对斑马鱼的早期发育都不是必需的。

未引用的参考文献

Novoa和Figueras，2012；Quast等，2013；Wang等，2015；Wong等，2022；Liu等，2025。

数据与材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在文章（及其附加文件）中

CRediT作者贡献声明

M.M. - 构思、正式分析、研究方法、写作——初稿准备。N.P.、M.M.、L.P.、T.P. - 稳定基因敲除品系cry1a^-/-和cry1b^-/-的建立。M.Z.、M.MAR.和Z.B. - 研究。A.M. - 微生物组分析、研究、写作——初稿准备。W.S.和M.A. - 病毒载量研究、写作——初稿准备。M.C.和L.P. - 资金获取。M.C.、K.R.和L.P. - 资源提供、构思

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

资助

本工作得到了波兰国家科学中心的资助[资助编号：2018/31/D/NZ6/02321]

致谢

雅盖隆大学动物学与生物医学研究所进化免疫学系斑马鱼核心设施的建立得到了优先研究领域BioS在“卓越计划”下的资助。

我们感谢发育生物学与无脊椎动物形态学系的Malgorzata Sekula在微生物组研究中的帮助，以及斑马鱼核心设施的Dariusz Gajdzinski和Mateusz Pociecha