综述：CRISPR/Cas9基因编辑系统在微藻代谢工程中的应用以及功能性食品成分的合成策略

《Biotechnology Advances》：Application of CRISPR/Cas9 gene editing system in microalgal metabolic engineering and synthetic strategies of functional food ingredients

CRISPR/Cas9技术通过精准编辑微藻代谢通路，显著提升高价值营养素如不饱和脂肪酸、功能性蛋白及色素的产量，同时面临细胞壁强、转化效率低等挑战，需优化sgRNA设计和高保真Cas9酶以推动微藻成为可持续的“细胞工厂”。

　　

朱伟普|薛旺|陈一涵|李继山|何欣欣|陈伟超|赵超

福建农林大学海洋科学学院，福州350002，中国

摘要

微藻是天然且可持续的生物资源，富含脂质、蛋白质和功能性色素等高价值营养成分，在功能性食品、膳食补充剂和天然色素领域具有巨大潜力。然而，天然微藻中目标成分的产量往往不足以满足商业化需求。CRISPR/Cas9基因编辑系统是一种革命性技术，能够精确有效地改进微藻，提升其营养价值和产量。本文首先概述了CRISPR/Cas9系统的基本原理，包括其核心组成部分和基因编辑机制，然后总结了该技术在微藻中的应用，重点介绍了通过修改代谢途径来富集特定营养成分的成功案例，如增加脂质中的不饱和脂肪酸含量、提高可食用蛋白质的比例以及丰富具有抗氧化特性的天然色素。此外，本文还讨论了将这项技术应用于微藻时面临的主要挑战，包括由于细胞壁坚硬导致的递送困难、遗传转化效率低以及脱靶效应的风险。最后，本文提出了应对这些挑战的前沿策略，如开发高保真度的Cas9酶和优化单导向RNA（sgRNA）设计。这些技术的持续进步正推动微藻成为高效且可持续的“细胞工厂”，为食品工业提供更多天然、健康和高价值的功能性成分。

引言

微藻具有丰富的生物多样性，目前已发现约50,000种。它们在自然生态系统中通过促进物质循环发挥着关键作用。其广泛的遗传多样性和代谢多样性使它们能够在多种栖息地中繁衍生息，甚至在高温度和高盐度环境中也能生存。许多微藻种类富含蛋白质和脂质，包括多不饱和脂肪酸（PUFAs），如二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA），以及类胡萝卜素及其衍生物（如虾青素和叶黄素）。它们还产生其他生物活性化合物（如硫酸化多糖和花色素）（Gupta等人，2023年）。这些特性使得微藻在食品、制药、生物能源、增强免疫功能、预防心血管疾病和生物柴油生产等领域得到广泛应用。微藻是水生环境中的主要初级生产者，能够快速合成PUFAs，尤其是必需脂肪酸EPA和DHA。

微藻中的DHA是一种重要的多不饱和脂肪酸（PUFA），具有显著的抗炎和免疫调节作用。它能激活抗炎途径，增强肝脏保护，并支持免疫细胞的活力。这些特性使其在缓解类风湿性关节炎等炎症性疾病方面表现出效。此外，DHA通过改善血脂和血糖水平、减少高脂饮食引起的脂肪积累以及提高HDL水平来调节代谢，从而有助于减轻心血管疾病和肥胖相关并发症。角鲨烯在提高低氧耐受性方面也显示出潜力，成为新的研究方向（Khan等人，2021年）。除了DHA，微藻脂质还含有其他有价值的化合物，如角鲨烯，这是一种具有抗炎、抗肿瘤和心脏保护特性的三萜类化合物。角鲨烯在提高低氧耐受性方面具有潜力，成为新的研究焦点。其他PUFAs，如亚油酸和花生四烯酸，对多种健康问题具有治疗潜力，包括高血压、呼吸系统疾病、消化性溃疡和精神分裂症。这种多功能性使得微藻脂质成为有价值的营养补充剂和健康产品成分。

与传统鱼类来源相比，微藻在生产PUFA方面具有多个优势，包括营养需求简单、生长速度快、污染物含量低且无鱼腥味（Mao等人，2022年）。微藻油的高营养价值和安全性已通过毒理学和遗传毒性评估得到证实，支持其在食品和营养补充剂中的广泛应用。此外，微藻DHA的理化性质符合国家标准，使其成为可靠的原材料（Chen等人，2016年）。

微藻营养价值极高，含有大量的蛋白质、氨基酸和碳水化合物。某些种类，如小球藻（Chlorella）和盐生杜氏藻（Dunaliella salina），其碳水化合物含量超过干重的40%。在蛋白质方面，红藻和螺旋藻（Spirulina）的含量分别高达60%和60~71%，远高于大豆（38%）和鸡蛋（13.2%）（Churchward-Venne等人，2017年）。微藻蛋白质的优势不仅在于其含量，还在于其平衡的氨基酸组成。微藻可以合成20种不同的氨基酸，其中包括8种必需氨基酸。例如，小球藻中的必需氨基酸浓度符合世界卫生组织（WHO）和联合国粮食及农业组织（FAO）的标准。因此，微藻蛋白被认为是一种理想的可持续蛋白质来源，并已广泛应用于食品配方和动物饲料中。

微藻蛋白不仅是一种极其营养丰富的食物，还因其多样的生物活性而备受关注。微藻蛋白及其水解物或肽具有显著的抗氧化、抗癌、降压、抗炎和抗动脉粥样硬化作用。这些生物活性归因于酶蛋白、肽和蛋白质复合物的参与（Wang等人，2022b）。藻胆蛋白包括藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白（PC）和异藻蓝蛋白（APC）。

来自微藻的天然色素，如叶绿素、类胡萝卜素、虾青素和岩藻黄质，在光合作用中起着重要作用，并具有出色的抗氧化、抗炎和抗菌特性（Aditi等人，2025年）。因此，这些色素被视为食品工业中极具价值的天然功能性成分。与合成色素相比，微藻衍生的色素更符合“天然、健康和可持续”的食品趋势。它们是人工染料的优秀替代品，同时还能用于营养强化和功能性食品的制备（Siladji等人，2024年）。这些色素主要由类胡萝卜素、藻胆素、叶绿素和岩藻黄质组成。除了在藻类光合作用中的重要作用外，它们还表现出显著的抗氧化、抗炎和抗菌生物活性。它们因能够清除自由基（自由基会损害细胞并增强免疫功能）而受到深入研究。

微藻中的叶绿素和类胡萝卜素是天然存在的化合物，在许多领域都有广泛应用。这些色素在光合作用中捕获光能，支持微藻生长。微藻繁殖迅速，所需资源少，使得类胡萝卜素成为具有可持续性的宝贵生物活性物质。因此，它们被认为是合成染料和动物来源化合物的可持续替代品。叶绿素是光合作用中的主要色素。除了吸收和转化光能外，它还具有抗氧化、抗炎和调节肠道功能的生理益处。微藻中的叶绿素含量通常占其体重的0.5%到1.5%，而普通小球藻（Chlorella vulgaris）中的叶绿素含量可高达7%（Megawati等人，2022年）。此外，岩藻黄质是一种典型的褐藻类胡萝卜素，因其特殊的分子结构而具有多种健康益处，如抗肿瘤、抗肥胖和调节血糖的作用。

近年来，基因工程、代谢调控和人工智能算法的进步使得对微藻中生物活性化合物合成途径的研究更加深入。这些发展显著提高了生物活性化合物的产量。这些技术的应用不仅扩展了微藻生物活性物质在食品、医药和生物能源领域的应用，还为生物资源的可持续开发提供了新方法。本文综述了CRISPR/Cas9技术在微藻中增强生物活性化合物生物合成和调控的应用。

CRISPR/Cas9基因编辑系统概述

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）是一种开创性的基因组编辑技术，对基因工程领域产生了重大影响。该技术属于第三代位点特异性基因组编辑技术，前两代分别为锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）。ZFN和TALEN技术都较为繁琐且成本较高，因为它们依赖于

微藻中基因编辑的应用实践和策略

微藻是单细胞光合生物，含有多种生物活性化合物，包括脂质、蛋白质和色素等。由于其丰富的代谢特性和独特的生理特性，微藻在可再生能源、生物医学、食品工业和环境监测等领域具有广泛的应用价值，对科学研究和发展具有重要意义（Poulhazan等人，2021年）

在微藻中实施CRISPR/Cas9的挑战和潜在策略

在合成生物学时代，藻类基因工程有望生产新的代谢产物，包括色素、脂质、蛋白质和多糖。CRISPR/Cas9系统已成为基因组编辑的基石工具。然而，在微藻中成功应用CRISPR/Cas9面临一些挑战，如编辑效率低、转化方法有限以及需要精确的调控机制。克服这些挑战将

结论

CRISPR/Cas9技术在微藻中的潜在应用将为生物活性化合物的可持续代谢工程开辟新视野，不仅适用于生物燃料，也适用于制药和高价值营养制品。尽管在模式藻类（如C. reinhardtii和P. tricornutum）中已经取得了显著进展，但该技术在其他藻类中的应用仍较为有限

未引用的参考文献

Jeong等人，2023年

Kumar等人，2020年

Lyon和Mock，2014年

利益冲突声明

作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

该项目由FuXiaQuan国家自主创新示范区协同创新平台项目资助（2023FX0001）。图表使用Biorender软件制作。