黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌类型之一，其遗传异质性导致预后不良和频繁复发[1]。尽管癌症治疗在控制肿瘤生长和延长患者生存方面取得了一些进展[2,3]，但传统治疗方法往往受到脱靶效应和显著毒性的困扰，从而严重影响患者的生活质量[4,5,6]。这些挑战凸显了需要创新的治疗策略，以精确靶向驱动黑色素瘤的致癌基因，以改善临床结果和患者福祉。
斑马鱼模型被认为是黑色素瘤研究和药物评估中最合适的动物模型之一，因为它在关键癌症相关信号通路方面与人类高度保守[7,8,9]。大约70%的人类致癌基因在斑马鱼中有同源对应物，使得肿瘤发展的分子机制高度相似[10]。此外，斑马鱼对异种移植的人类黑色素瘤细胞具有很强的免疫耐受性[11]，这有助于准确模拟肿瘤微环境和药物反应，对于评估抗肿瘤药物的效果非常有价值[7]。值得注意的是，斑马鱼的肿瘤异种移植模型为预测各种类型癌症的个性化治疗策略提供了平台[12,13]。当与黑色素瘤细胞和斑马鱼异种移植模型结合使用时，可以加速纳米药物的临床前开发，同时降低研发成本[14,15,16]。
近年来，基因编辑通过实现对驱动肿瘤生长和转移的致癌基因的精确修饰，彻底改变了癌症治疗方式，相比缺乏特异性的传统化疗具有优势[17,18,19]。在各种工具中，CRISPR/Cas系统因其能够选择性改变基因组、转录组和表观基因组而受到重视[20,21,22,23]。CRISPR/Cas9利用单导向RNA（sgRNA）引导的Cas9核酸酶诱导位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），从而实现靶向基因破坏或校正[24,25]。然而，尽管其具有治疗潜力，但由于Cas9蛋白和sgRNA是大分子，需要高效且安全地输送到癌细胞中才能实现有效的基因编辑效果，因此临床应用受到限制。病毒载体已被探索用于输送CRISPR/Cas组分；然而，它们存在多种局限性，包括免疫原性、包装能力有限以及持续的Cas9表达，这增加了脱靶效应的风险[26,27]。非病毒输送系统，特别是脂质纳米颗粒（LNPs），作为一种有前景的替代方案，已在COVID-19大流行期间成功应用于mRNA疫苗的输送[28,29]。LNPs通常由四种关键成分组成：可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质[30,31]。这些结构具有高载荷封装效率、生物相容性和可扩展制造等优点。然而，LNPs的系统给药往往会导致其在非靶组织（尤其是肝脏）中的积累，限制了其对肿瘤部位的有效输送[32]。为了克服这些挑战，人们投入了大量努力来设计具有肿瘤靶向能力的LNPs[33,34]。使用靶向LNPs不仅解决了输送大分子基因编辑载荷的关键问题，还减少了脱靶效应，提供了更精确的治疗方法[35,36]。
一种有前景的方法是使用靶向配体，如肽，将其连接到LNPs表面以提高肿瘤特异性。肽作为靶向分子具有吸引力，因为它们分子量小、易于合成、稳定性高，并且对肿瘤细胞上过度表达的特定受体具有强亲和力[37,38]。这些特性使肽能够实现精确的肿瘤靶向，同时保持低毒性和高生物相容性，使其成为开发靶向药物输送系统的理想候选者[39,40,41]。CD44是一种参与细胞间相互作用、粘附和迁移的跨膜糖蛋白，在黑色素瘤中经常过度表达[1,42]。它通过促进上皮-间充质转化（EMT）、增强转移潜能和维持癌干细胞样表型来促进肿瘤进展[43,44]。由于在黑色素瘤细胞中的高表达，CD44成为治疗应用中的理想靶向分子[45,46,47]。值得注意的是，A6肽已被证明能有效结合过度表达CD44的肿瘤，包括黑色素瘤，为靶向输送提供了一个有前景的平台[45,48,49]。
在这项研究中，我们报道了开发了用于靶向输送CRISPR/Cas9组分到皮肤黑色素瘤细胞的肽修饰脂质纳米颗粒（LNPs）。具体来说，我们使用CD44靶向肽A6来功能化LNPs，以提高其对黑色素瘤的肿瘤特异性。这些功能化的LNPs装载了CRISPR/Cas9组分，包括Cas9 mRNA和针对polo样激酶1（PLK1）的单导向RNA（sgRNA），PLK1是细胞周期进展的关键调节因子和已知的致癌靶点[50,51]。通过将CD44靶向肽纳入LNP结构，我们在过度表达CD44的黑色素瘤细胞中实现了显著的细胞摄取和基因编辑效率提升。我们的体外和体内结果表明，PLK1表达受到显著抑制，从而有效抑制了黑色素瘤的生长并增强了抗肿瘤效果。这项工作突显了肽修饰LNPs作为高度特异性和有效的癌症治疗基因编辑输送平台的潜力。通过结合CRISPR/Cas9技术的精确性和肽修饰LNPs的靶向能力，我们提供了一种多功能策略，以提高基因治疗的效果和特异性。此外，这种输送系统在需要靶向基因组编辑方法的其他疾病治疗中也具有广泛的应用前景。
