《Advanced Functional Materials》：Lipid Nanoparticles for the Delivery of CRISPR/Cas9 Machinery to Enable Site-Specific Integration of CFTR and Mutation-Agnostic Disease Rescue
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本文报道了一种创新的脂质纳米颗粒（LNP）递送平台，可同时包载CRISPR/Cas9 mRNA、单向导RNA（sgRNA）及线性双链DNA（ldsDNA）供体模板，通过同源定向修复（HDR）机制将全长CFTR基因精准整合至囊性纤维化（CF）患者气道上皮细胞基因组中，成功恢复了约80%的氯离子（Cl?）电流功能，为约10%无法使用调节剂疗法的CF患者提供了突变非依赖性的基因治疗新策略。
1 引言
基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9及其快速发展的衍生工具，正在彻底改变遗传性疾病的治疗格局。这些技术通过操纵患者基因组，有望实现对遗传病根本原因的持久性矫正。然而，这些基因组编辑技术的成功临床应用，需要将必需的生物分子组分（如Cas9核酸酶、向导RNA和/或同源供体DNA模板）协调地递送至细胞内。脂质纳米颗粒（LNP）作为一种有前景的基因递送平台，在辉瑞-BioNTech和Moderna的COVID-19 mRNA疫苗取得广泛成功后备受关注。囊性纤维化（CF）是由单基因——囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）基因——突变引起的遗传病，是基因治疗的理想目标。尽管许多患者可通过调节CFTR蛋白功能的药物进行治疗，但约10%患者的突变类型对这些干预措施无反应，且这些突变在非白人患者群体中比例过高。因此，针对这些无法治疗突变的基因疗法具有重大意义。
近年来，已有研究证明LNP能在CF模型中实现稳健的基因编辑，但多数策略依赖于短的单链寡核苷酸（ssODN）供体模板或碱基编辑器来纠正特定的单个突变。相比之下，依赖于大DNA供体模板的CRISPR策略（如Cas9介导的HDR整合）具有独特优势：首先，插入长编码序列提供了一种突变非依赖性的解决方案，无需针对特定突变进行定制，有利于“现货型”疗法的转化，降低成本并增强可扩展性；其次，插入整个校正后的基因允许使用密码子优化和/或功能增益变体的供体盒，可能克服递送和编辑效率的限制。然而，合成纳米载体（如LNP）对这些大容量货物的包载能力仍知之甚少，尤其是对于线性双链DNA（ldsDNA）的递送。ldsDNA分子比其单链对应物分子量更大、刚性更强，因此更难以卷曲。
本研究报道了一种LNP平台的设计与验证，该平台可同时包载编码Cas9的mRNA转录本、单向导RNA（sgRNA）和大的ldsDNA供体模板货物。这些试剂旨在通过同源定向修复（HDR）介导的位点特异性整合，将密码子优化的、包含5 kb CFTR编码序列和50 bp同源臂的供体模板插入内源性CFTR基因的5‘非翻译区（UTR），同时保持内源性CFTR启动子和内含子的完整，以实现对任何CF致病突变的校正。
2 结果
2.1 脂质纳米颗粒组分的选择
传统的LNP配方包含可电离脂质、辅助磷脂、固醇和聚乙二醇（PEG）缀合脂质。这些成分的确切身份和摩尔比需要根据应用进行优化。本研究旨在建立一种针对疾病相关的人支气管上皮细胞系（16HBE14o-）优化的LNP配方。经过筛选，最终确定的优化配方包含50 mol% SM-102、38.5 mol% β-谷固醇、10 mol% 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1.5 mol% 1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DMG-PEG2000）。该配方在16HBE14o-细胞中实现了95%的转染效率，并保持了80%以上的细胞活力。
2.2 基因编辑货物比例的筛选
为实现HDR介导的位点特异性插入，需要细胞内递送编码Cas9内切核酸酶的mRNA转录本、靶向特定基因组位点的sgRNA以及作为插入序列模板的供体DNA构建体。研究团队利用稳定表达蓝色荧光蛋白（BFP）的16HBE14o-报告细胞系，系统筛选了mRNA、sgRNA和单链寡核苷酸（ssODN）供体之间的最佳重量比（w/w）。首先固定ssODN:mRNA比例为3:1，滴定sgRNA:mRNA比例（0.8:1至2:1），发现sgRNA:mRNA比例为1.2:1时HDR效率最高。随后固定sgRNA:mRNA比例为1.2:1，滴定ssODN:mRNA比例（2:1至4:1），确定ssODN:mRNA比例为3:1时HDR效率最优。因此，后续实验采用sgRNA:mRNA为1.2:1 w/w，ssODN:mRNA为3:1 w/w的比例。
2.3 优化LNP配方以容纳ldsDNA供体盒
为进一步评估LNP递送更大ldsDNA供体模板（编码完整基因）的能力，研究设计了靶向内源性CFTR基因5‘UTR的mCitrine报告基因ldsDNA构建体。比较了将ldsDNA与RNA货物分装于不同LNP（sepLNPs） versus 将所有三种基因编辑组分共同包载于单一LNP（togLNPs）的效果。结果表明，togLNPs在实现位点特异性整合效率方面优于sepLNPs，无论是否使用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂AZD7648和DNA聚合酶θ（PolΘ）抑制剂ART558来抑制竞争性的修复途径（非同源末端连接NHEJ和微同源介导的末端连接MMEJ）。当使用编码全长CFTR（约5 kb）的更大ldsDNA供体时，需要进一步优化。通过筛选ldsDNA:mRNA比例（2:1, 3:1, 4:1 w/w）和氮磷比（N/P ratio, 5, 7, 9, 11, 13），发现ldsDNA:mRNA为3:1 w/w且N/P为11时，在G542X突变细胞中实现了最高约3.5%的整合效率，且细胞存活率良好。剂量滴定实验表明，50 ng mRNA剂量即可达到约3.3%-3.5%的整合效率。
2.4 LNP介导的位点特异性整合恢复G542X突变人支气管上皮细胞的CFTR功能
实验验证了AZD7648和ART558并非实现有效整合所必需，未使用药物的样本仍能达到约2.85%的整合效率。尽管等位基因整合效率低于4%，但Western blot蛋白印迹分析显示，经过编辑的G542X细胞（G542X-CFTR）的CFTR蛋白表达量达到正常16HBE14o-对照组的83%-123%。功能测定（使用2通道尤斯灌流室系统和24通道跨上皮电流钳TECC系统）表明，G542X-CFTR细胞单层的CFTR氯离子电流恢复至正常16HBE14o-细胞单层电流值的约80%-160%，且所有样本的跨上皮电阻（TEER）均大于800 Ω×cm2。这首次证明了LNP平台可包载并递送如此大小的ldsDNA盒，通过位点特异性插入整个基因序列实现功能表型挽救。
2.5 LNP包载大dsDNA构建体
通过低温透射电子显微镜（cryo-TEM）对仅含Cas9 mRNA和sgRNA、仅含CFTR编码ldsDNA、以及同时含三者（Cas9 mRNA、sgRNA、CFTR ldsDNA）的LNP进行了表征。所有三种LNP类型主要包含尺寸约30-100 nm的颗粒，具有圆形或多面体形态及电子致密的多层膜核心。然而，在含有ldsDNA的样品中也观察到了非常大（>200 nm）且形态不规则的颗粒。这种异质性与动态光散射（DLS）和RiboGreen assay测得的更宽的尺寸分布和较低的包封效率一致。cryo-TEM图像证实了在所有样品中均形成了包载核酸的多层膜颗粒，表明大的ldsDNA构建体可以被包载在LNP内。
3 讨论
本研究证实了由市售脂质试剂组装的LNP能够包载并促进ldsDNA货物的递送，并能用于协调CRISPR/Cas9系统的所有组分递送至患有罕见CF致病突变G542X的纯合子人支气管上皮细胞，实现编码整个CFTR基因的HDR供体模板的位点特异性插入，从而恢复气道上皮的蛋白表达和正确的离子通道功能。与仅含RNA的LNP相比，含ldsDNA的LNP在形态上存在差异（如总体尺寸更大、多分散性更高、包封效率更低），这可能源于ldsDNA供体更大的尺寸和/或刚性导致的组装热力学改变，或空间位阻影响了可电离脂质胺与ldsDNA磷酸骨架的静电相互作用。尽管CFTR整合效率相对 modest，但在编辑样本中观察到的高频率（40%-60%）插入缺失（indel）表明，细胞的摄取和内体逃逸可能并非该平台的主要限制因素。限制效率的因素更可能在于细胞内部生物学过程，例如供体向细胞核的运输效率低，以及HDR效率本身受细胞周期依赖性和竞争性修复途径（NHEJ, MMEJ）的限制。本研究证明，即使整合水平低于3%，使用密码子优化的ldsDNA供体盒也能实现CFTR离子通道功能的强劲恢复，这为克服递送和整合效率障碍提供了潜在解决方案。该LNP平台具有模块化特点，易于与专门设计用于克服CF治疗面临的物理和免疫障碍的其他LNP技术结合。
4 展望与未来前景
本研究成功证明了LNP介导的整个基因整合可实现功能性表型矫正，为LNP的货物携带能力设立了新基准。具备此能力的LNP为突变非依赖性校正多种单基因疾病（如血友病A、腺苷脱氨酶缺乏性重症联合免疫缺陷症ADA-SCID）提供了灵活的平台。未来需要针对ldsDNA构建体的包载和递送，设计和测试大规模的可电离脂质库，优化LNP配方，以推动可临床转化的基因疗法的发展。
5 实验部分/方法
（此部分详细描述了研究所用的化学品、LNP的配制合成与表征方法、细胞培养条件、转染流程、流式细胞术、活细胞核染色与共聚焦显微镜、DNA提取与分析、尤斯灌流室分析、TECC分析、Western blot、双链DNA供体合成与扩增、液滴数字PCR（ddPCR）整合分析、等位基因破坏测量、BFP报告细胞系构建以及统计学分析方法等具体实验步骤和条件。）
