《Talanta》：CRISPR-Cas12a biosensing technology advances and applications in precision diagnostics and cancer research
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CRISPR-Cas12a技术兼具基因编辑与分子诊断功能，在核酸及非核酸检测中展现高灵敏度和多场景适应性，其优化策略与集成化平台发展推动临床转化。
臧子瑜|陈杰|董毅|陈琳琳|杨美华|穆美雅|周丽仁辉|张伟|邹广荣|刘超星
中山大学医学院，中国广东省深圳市，518107
摘要
CRISPR-Cas12a已成为一种多功能生物技术平台，在生物传感、诊断和精准基因组编辑领域具有重要的应用价值。该系统由一条crRNA激活，表现出对目标序列的特异性切割活性，并能识别可编程的PAM（Protospacer-Agouti-Motif）序列。这些特性为准确检测多种生物标志物提供了坚实的基础。其检测能力涵盖核酸目标（如病毒RNA和癌症突变）以及非核酸分子（如外泌体和蛋白质）。最新进展表明，该系统具有多重温度适应性、快速动力学特性，并且能够同时处理DNA和RNA目标。技术改进包括利用机器学习辅助设计crRNA以提高预测准确性，以及开发出克服传统PAM限制的工程化EnAsCas12a变体。值得注意的成就包括实现阿托摩尔级灵敏度的熵驱动电路、兼容智能手机的四通道定量检测系统，以及可在30分钟内完成的所有集成工作流程。传感器设计的进步（如金属有机框架封装和高性能适配体传感器）进一步扩展了其检测能力。在肿瘤学研究中，CRISPR-Cas12a技术为全面分析肿瘤微环境（TME）中的复杂分子网络提供了强大工具，并有助于超灵敏地检测早期癌症生物标志物。此外，在基因组编辑方面，CRISPR-Cas12a凭借独特的修复途径、多样的递送方式及高效的转基因模型构建能力，扩展了其功能范围，超越了传统诊断应用。随着持续发展，这项技术有望发展成为整合肿瘤微环境研究、即时癌症诊断和可编程基因组工程的综合性平台，为生物医学研究和临床应用提供创新解决方案。
引言
CRISPR-Cas系统在细菌和古菌中作为一种适应性免疫机制，保护它们免受外来遗传元素的侵害。该系统分为两大类、六种类型和33个亚型[1]。I类CRISPR/Cas3系统在诊断领域表现出良好效果[2]，而V类Cas9则广泛应用于基因编辑[3]。随着CRISPR-Cas12a（最初称为Cpf1）的发现与研究，它被归类为V类系统的新成员[4]。2015年，Zetsche等人首次报道了来自Francisella novicida U112的Cas12a能够通过crRNA引导进行质粒干扰，证实了其内切酶活性[5]。该系统由Cas12a蛋白、crRNA、PAM序列（通常为5′-TTTV-3′）、目标DNA及辅助因子组成，作为单一crRNA引导的内切酶发挥作用[4,6,7]。
Cas12a属于一个包含至少46个非冗余同源物的蛋白质家族，例如AsCas12a（Acidaminococcus属）、LbCas12a（Lachnospiraceae菌属）和FnCas12a（Francisella novicida）[4,7]。其中，AsCas12a和LbCas12a在哺乳动物系统中的编辑效率最高。这两种蛋白主要识别TTTV PAM序列，但也能结合CTTV和TCTV等变体[8, [9], [10]]。尽管LbCas12a体积较小，但其编辑效率更高且脱靶率高于AsCas12a。工程化的enAsCas12a显著提升了催化活性[11,12]。最近发现的FnCas12a和hyperCas12a等变体进一步拓宽了其在病原体检测和基因编辑中的应用潜力[13]。由于在核酸检测和基因编辑方面的独特优势，Cas12a已成为生命科学研究中的关键工具。
结构与功能域
Cas12a蛋白具有双叶结构。REC（RuvC-Nuclease Complex）叶包含REC1/REC2结构域，负责crRNA的结合；NUC（Nucleic Acid）叶包含RuvC（内切酶结构域）、PI（PAM识别结构域）、WED（稳定crRNA 5′端结构域）和BH（连接REC和NUC叶的结构域）[6,14,15]。RuvC内切酶结构域由RuvC I-III亚区组成，crRNA处理位点位于WED-III亚区[6,16,17]。
crRNA引导的目标识别与切割
crRNA包含一个保守的直接重复（DR）区域和一个可编程序列
利用CRISPR-Cas12a的切割活性进行精准基因编辑
Cas12a的切割活性使其成为基因编辑中的强大工具。具体而言，切割目标双链DNA时会产生交错的双链末端（粘性末端），这有助于精确的DNA整合定向，特别有利于同源定向修复（HDR）。这些粘性末端增强了Cas12a的功能，使其能够更有效地进行HDR和基因组整合CRISPR-Cas12a在核酸诊断中的应用
研究表明，CRISPR-Cas12a不仅具有切割活性，还具有转录切割（cis-cleavage）活性。这一特性显著提升了其在核酸诊断中的应用效果。将CRISPR-Cas12a与核酸扩增、光解控制和级联扩增技术结合，开发出了快速、灵敏的即时核酸诊断方法，有效检测了DNA和RNA病毒及食物中的病原体CRISPR-Cas12a在非核酸诊断中的应用
除了核酸检测外，CRISPR-Cas12a还成为非核酸诊断的多功能平台。这一扩展基于将非核酸信号转化为可激活的核酸触发剂，并利用Cas12a的切割活性。应用范围包括小分子、蛋白质、金属离子、循环肿瘤细胞和抗生素的检测[105]。
CRISPR-Cas12a系统的优化策略
深入研究CRISPR组分的详细机制和调控特性，可显著提升该技术的精确度、灵敏度和可编程性[124,125]。已有大量研究致力于优化这一系统。Cas12a蛋白吸引了大量研究关注，工程化改造引入了新的功能，例如光控激活[126]和扩展的目标序列识别能力CRISPR-Cas12a在肿瘤微环境分析及早期癌症检测中的应用
肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含多种细胞类型、细胞外基质成分和信号分子，这些因素在肿瘤发生、进展和转移中起关键作用[155]。TME的关键成分包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）、微小RNA（miRNAs）和多种肿瘤相关mRNAs。准确检测这些生物标志物对早期癌症诊断和治疗监测至关重要展望
凭借出色的操作灵活性（如广泛的温度适应性、双DNA/RNA特异性以及具有放宽PAM要求的工程化变体），CRISPR-Cas12a有望发展成为下一代综合性诊断平台。机器学习优化的crRNA、实现阿托摩尔级灵敏度的熵驱动电路以及一体化系统等关键技术将加速其临床转化。我们预计未来会出现集成在智能手机中的CRediT作者贡献声明臧子瑜：撰写初稿、数据可视化、形式分析、概念构建。陈杰：撰写初稿、验证、方法设计、实验设计、数据管理。董毅：撰写初稿、验证、方法设计、实验设计、数据管理。陈琳琳：撰写初稿、软件开发、项目协调、方法设计、形式分析、数据管理。杨美华：审稿与编辑、撰写初稿、项目协调利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（22577165, 22307150）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515012319, 20230807110315032）以及深圳市科技创新计划（JCYJ20240813150427036, JCYJ20230807110315032）的支持。
