《The Veterinary Journal》：Development and characterization of a recombinant attenuated duck adenovirus B2 vector expressing the
vp3 gene of short beak and dwarfism syndrome virus
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鸭腺病毒B2（DAdV-B2）和短喙侏儒综合征病毒（SBDSV）是鸭产业的主要病原体，本研究通过连续传代获得非致病性DAdV-B2疫苗株BG18cm20，并利用CRISPR/Cas9技术在其基因组中插入GFP或SBDSV VP3基因，成功构建重组腺病毒BG18cm20-GFP和BG18cm20-SBDSV-VP3。体外实验表明重组病毒高效复制且表达稳定，电镜观察证实VP3蛋白可自主组装为病毒样颗粒，验证了BG18cm20作为安全有效的鸭用腺病毒载体平台，为后续双价疫苗开发奠定基础。
作者：広聚友、江丹丹、程晓霞、曾莉、肖世峰、朱晓莉、王绍、陈少英、陈世龙
中国福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350003
摘要
鸭腺病毒B2（DAdV-B2）和短喙矮小综合征病毒（SBDSV）是全球鸭产业中造成严重经济损失的主要病原体。为了开发能够表达SBDSV抗原的重组DAdV-B2病毒，我们首先通过连续传代毒力强的BG18株病毒于麝香鸭胚胎成纤维细胞中，获得了减毒的DAdV-B2株BG18cm20。致病性评估证实BG18cm20对麝香鸭雏鸭无毒，验证了其作为病毒载体骨架的安全性。利用CRISPR/Cas9辅助的同源介导末端连接技术，我们将GFP报告基因或SBDSV的vp3基因插入BG18cm20的基因组位点（ORF20-ORF53），成功构建了重组病毒BG18cm20-GFP和BG18cm20-SBDSV-VP3。体外实验表明，这些重组病毒能够高效复制，并在15次连续传代后仍保持插入基因的稳定表达。值得注意的是，透射电子显微镜观察发现BG18cm20-SBDSV-VP3表达的VP3蛋白能够自组装成类似SBDSV的病毒颗粒。综上所述，BG18cm20是一个安全有效的病毒载体平台，可用于表达外源抗原。BG18cm20-SBDSV-VP3的构建和体外特性研究为未来开发针对DAdV-B2和SBDSV的双价疫苗奠定了基础。
引言
鸭腺病毒B（DAdV-B）属于腺病毒科（Adenoviridae）中的禽腺病毒属（Aviadenovirus），是水禽的重要病原体（Chen等人，2022年）。DAdV-B是一种无包膜病毒，其二十面体衣壳包裹着约43 kb的双链线性DNA基因组（Chen等人，2022年）。DAdV-B基因组编码多种非结构蛋白（如DNA聚合酶、52 K、100 K、22 K和ORF19）以及三种主要结构蛋白：六邻体蛋白、纤维蛋白和五邻体蛋白，这些蛋白对病毒颗粒的组装和感染性至关重要（Chen等人，2022年；Shi等人，2022年）。鸭腺病毒B包含两种基因型，DAdV-2 GR代表基因型1（DAdV-B1），而在中国麝香鸭群中分离出的DAdV-3株属于基因型2（DAdV-B2）（Chen等人，2022年）。DAdV-B1 GR最早于1982年在法国麝香鸭中分离鉴定（Bouquet等人，1982年；Marek等人，2014年）。自2014年以来，中国多个地区的鸭场报告了DAdV-B2的暴发，其特征是肝脏出现苍白病变（Chen等人，2022年；Tan等人，2024年；Zhang等人，2016年）。感染后的鸭子表现出疲劳和突然死亡的症状，尸检发现肝脏呈苍白出血状态（Chen等人，2022年）。该病毒感染导致受影响鸭群的发病率和死亡率分别为20–50%和10–50%，给产业带来了重大经济损失（Chen等人，2022年；Zhang等人，2016年）。迄今为止，尚未开发出针对DAdV-B2的商业疫苗，这使得病毒在鸭场中持续传播，并促使多种突变株的出现（Chu等人，2022年；Shi等人，2022年；Tan等人，2024年；Yin等人，2022年）。
短喙矮小综合征病毒（SBDSV）是另一种新兴的病毒病原体，近年来对鸭养殖业构成了严重威胁（Chen等人，2016b；Soliman等人，2020年）。自2015年首次在中国报道以来，SBDSV迅速传播到主要鸭生产地区（Chen等人，2016a；Chen等人，2016b）。该病毒具有广泛的宿主嗜性，在商业肉用品种（如樱桃谷鸭、北京鸭和骡鸭）中表现出特别的毒力，同时在中国主要家养水禽中仍具有致病潜力（Chen等人，2015年；Ning等人，2017年；Xiao等人，2017年）。SBDSV是一种新型的鹅细小病毒（GPV）变种，与经典GPV分离株在基因上存在显著差异，但在系统发育上与麝香鸭细小病毒（MDPV）的关系更密切（Chen等人，2016b）。SBDSV感染会导致严重的临床症状，包括生长迟缓、喙短和骨骼畸形，从而导致饲料转化效率显著降低和产量大幅下降（Chen等人，2016b；Xiao等人，2017年）。目前尚无针对SBDSV的商业疫苗，因此迫切需要开发预防SBDSV感染的疫苗。SBDSV的衣壳主要由VP1、VP2和VP3三种结构蛋白组成（Liu等人，2024年）。其中，VP3是最丰富的蛋白，并已被确定为关键的保护性抗原（Wang等人，2024b）。它能够在宿主体内诱导强烈的中和抗体反应，使其成为SBDSV疫苗开发的理想靶点（Xiao等人，2022年）。
腺病毒因其独特的优势而在人类和兽医医学领域成为有前景的疫苗载体：稳定的二十面体衣壳结构、在宿主细胞中的高效复制能力、易于基因操作以及较大的包装能力（Portugal等人，2024年；Wang等人，2023年）。这些优势已通过针对埃博拉病毒（Zhu等人，2017年）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）（Logunov等人，2021年）和非洲猪瘟病毒（ASFV）（Liu等人，2023年）等高致病性病原体的腺病毒载体疫苗的成功开发得到验证，这些疫苗在临床和田间应用中均表现出强大的保护效果。在禽类研究中，腺病毒载体主要集中在禽腺病毒上，如FAdV-1、FAdV-4和FAdV-9等血清型被探索作为家禽疾病疫苗的潜在载体平台（Deng等人，2013年；Francois等人，2004年；Guo等人，2023年；Pei等人，2018年）。然而，基于鸭腺病毒的研究相对有限，这阻碍了能够同时保护鸭子免受多种病原体感染的多价疫苗的开发。
为了建立鸭腺病毒载体平台，我们使用了通过连续细胞传代获得的减毒DAdV-B2株BG18cm20作为载体骨架。利用CRISPR/Cas9辅助的同源介导末端连接（HMEJ）基因编辑技术，我们构建了表达GFP报告基因或SBDSV vp3基因的重组DAdV-B2载体。这些重组病毒在体外表现出高效复制，并保持插入基因的稳定表达。重要的是，DAdV-B2-VP3重组病毒表达的VP3能够自组装成类似SBDSV的病毒颗粒。本研究为未来开发针对DAdV-B2和SBDSV的疫苗奠定了基础，同时也展示了鸭腺病毒作为多价疫苗平台的潜力。
细胞、病毒和抗体
Leghorn雄性肝癌（LMH）细胞系来自美国典型培养物收藏中心（ATCC）。初级麝香鸭胚胎成纤维（MDEF）细胞是从11天大的麝香鸭胚胎中制备的。LMH和MDEF细胞均在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Gibco）中培养，培养条件为37°C和5% CO2的培养箱。鸭腺病毒B2株BG18最初是在我们的实验室中分离的（Chen等人，2022年）。BG18cm20株
通过连续细胞传代生成减毒的鸭腺病毒B2株
开发安全的减毒鸭腺病毒株对于其作为病毒载体的应用至关重要。为了获得无毒的DAdV-B2株，我们将毒力强的BG18株在MDEF细胞中进行了总共160次连续传代。经过120次传代后，成功获得了无毒的BG18cm20株（图1A）。为了评估BG18cm20的减毒效果，我们对3天大的麝香鸭雏鸭进行了肌肉注射
讨论
病毒载体疫苗是一个有前景的平台，可以在一次免疫中传递多种异源抗原，提供多重保护（Wang等人，2023年），它们能够诱导全面的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，这使得它们在传统灭活疫苗或亚单位疫苗难以引发强烈免疫反应的禽类疾病控制中特别有价值（Wang等人，2024a）。在禽类疫苗载体中，新城疫病毒（NDV）和火鸡疱疹病毒
CRediT作者贡献声明
广聚友：撰写 – 原始草稿、验证、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。
江丹丹：方法学、研究。
程晓霞：方法学。
曾莉：方法学。
肖世峰：方法学。
朱晓莉：方法学。
王绍：方法学。
陈少英：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、研究、资金获取。
陈世龙：撰写 – 审稿与编辑。
伦理声明
本研究中使用的动物实验方案已获得中国福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物护理和使用委员会的批准。实验操作遵循了批准的指南（批准编号：MYLISC2025–055）。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了Youdao翻译工具来翻译部分文本。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对出版物的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国福建省农业科学院的项目（ZYTS202421、DWHZ2024–21）、福建省公益项目（2025R1073）以及福建省农业科学院的“5511”协同创新项目（XTCXGC2021018和XTCXGC2021012）的支持。
