《Biochemistry and Biophysics Reports》：Normal spermatogenesis and fertility in
Spmip8 deficiency male mice
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Spmip8（又称Tepp）是一种在哺乳动物中高度保守的蛋白质编码基因。尽管已有报道表明SPMIP8在睾丸中高表达，但其对精子发生及雄性生育力的功能仍不明确。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统构建了Spmip8缺陷小鼠，并通过生育力测试、组织
Spmip8（又称Tepp）是一种在哺乳动物中高度保守的蛋白质编码基因。尽管已有报道表明SPMIP8在睾丸中高表达，但其对精子发生及雄性生育力的功能仍不明确。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统构建了Spmip8缺陷小鼠，并通过生育力测试、组织学分析和免疫荧光技术对其表型进行了表征。SPMIP8定位于睾丸中延伸精子细胞的鞭毛。Spmip8敲除（KO）雄性小鼠表现出正常的生育力。野生型（WT）与Spmip8 KO小鼠在精子数量、活力、形态及运动学参数方面未发现显著差异。此外，KO小鼠中未检测到精子发生的明显缺陷。Spmip8 KO小鼠睾丸中多个Spmip基因（Spmip1、Spmip2、Spmip3、Spmip7和Spmip11）的转录水平升高，提示Spmip8基因在雄性生育力中的功能可能由其他Spmip家族成员代偿。综上所述，本研究结果表明Spmip8并非小鼠雄性生育力的必需基因。该研究有助于研究者避免重复工作，并进一步探索对精子发生及雄性生育力至关重要的基因。
研究背景与意义
维持雄性生育力依赖于具备受精能力的精子产生。哺乳动物的精子发生过程复杂且动态，涵盖精原细胞的有丝分裂、精母细胞的两次减数分裂以及单倍体精子细胞的分化成熟三个阶段。这一过程涉及睾丸内数千种蛋白质的协调表达，其中包含大量睾丸富集蛋白。尽管目前已鉴定出约2300个主要在睾丸表达的基因，但这些高表达蛋白编码基因在精子发生及雄性生育力中的具体作用大多尚不明确。精子鞭毛是具有微管结构的轴丝（axoneme），其双微管（DMTs）的稳定性由多种微管内蛋白（MIPs）增强。近期冷冻电子断层扫描研究发现了多种哺乳动物特有的精子MIP（sperm-MIPs），它们被认为为精子鞭毛的强力运动提供了必要的稳定性。Spmip基因家族编码了其中数种蛋白，虽然部分成员（如Spmip7和Spmip10）的功能已被证实与精子活力和生育力相关，但其他成员的作用仍知之甚少。Spmip8（亦称Tepp）是一个在哺乳动物中进化保守的基因，其编码的37 kDa蛋白特异性表达于睾丸、前列腺和胎盘，且作为动力蛋白修饰的双微管成分存在于精子鞭毛轴丝中，提示其可能参与精子发生。然而，SPMIP8在睾丸发育和精子发生过程中的具体功能尚未阐明。因此，本研究旨在通过构建Spmip8基因敲除小鼠模型，深入探究该基因在雄性生殖过程中的具体作用。该研究成果发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。
关键技术方法
研究人员采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统在苏州赛业生物科技有限公司构建了Spmip8敲除C57BL/6J小鼠，通过显微注射将Cas9 mRNA和sgRNAs注入受精卵细胞质。利用聚合酶链式反应（PCR）结合桑格测序对小鼠基因型进行鉴定。通过连续交配获得纯合突变小鼠。生育力测试通过将10周龄Spmip8?/?雄鼠与野生型雌鼠配对超过八周并记录每窝产仔数进行评估。精子参数分析采用计算机辅助精子分析（CASA）系统检测精子活力，血细胞计数板计数精子数量。组织学分析通过苏木精-伊红（H&E）染色观察睾丸和附睾组织形态。分子生物学分析包括从睾丸组织中提取总RNA进行实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测基因转录水平，以及通过蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光技术验证蛋白表达与定位。系统发育树分析利用MEGA X软件构建。
研究结果
3.1 SPMIP8在睾丸中特异性表达
系统发育分析表明SPMIP8在哺乳动物中高度保守。研究人员分析了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结果显示Spmip8在人类和小鼠的精子细胞中高表达，且在小鼠出生后第21天（P21）表达量升高并在精子细胞中达到峰值，表明其可能在精子形成（spermiogenesis）过程中发挥特定作用。
3.2 Spmip8敲除小鼠的构建与验证
利用CRISPR/Cas9技术成功构建了携带第2至8外显子8988bp缺失的Spmip8突变小鼠。桑格测序证实了基因的成功敲除。qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实Spmip8 KO小鼠睾丸中Spmip8转录本及SPMIP8蛋白完全缺失。免疫荧光染色显示SPMIP8蛋白定位于延伸精子细胞的鞭毛，而在KO小鼠中未检测到信号。
3.3 Spmip8敲除小鼠表现出正常的精子发生和雄性生育力
Spmip8敲除雄鼠在生长、发育和行为上未表现出显著异常。其睾丸重量、体重及睾丸/体重比与野生型相比均无显著差异。交配实验结果显示，Spmip8?/?雄鼠与野生型雄鼠的每窝产仔数无统计学差异。H&E染色显示KO雄鼠的睾丸和附睾中含有正常数量的精子，生精小管结构典型，包含从精原细胞到精子的各类型生殖细胞。通过γ-H2AX共免疫染色对生精小管分期观察，也未发现KO小鼠存在精子发生缺陷。
3.4 Spmip8缺陷不影响精子质量
对精子数量和活力的分析显示，Spmip8?/?与野生型小鼠之间无显著差异。H&E染色对成熟精子头部和鞭毛的形态学评估表明，KO小鼠未检测到显著的形态学异常。此外，在精子运动学参数方面，包括总活力、前向运动、平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）和曲线速度（VCL），均未检测到基因型依赖性差异。
3.5 Spmip基因的功能冗余
为进一步探究Spmip8非雄性生育力必需基因的原因，研究人员检测了Spmip家族基因在KO雄鼠中的mRNA表达。结果显示，与野生型相比，Spmip8?/?小鼠睾丸中Spmip1、Spmip2、Spmip3、Spmip7和Spmip11的转录水平显著上调。
讨论与结论
本研究构建了Spmip8突变小鼠并探究了SPMIP8在精子发生和雄性生育力中的功能。尽管SPMIP8在睾丸中特异性表达，但研究人员并未在Spmip8敲除小鼠中观察到显著的生育力损伤。组织学分析显示突变小鼠睾丸和附睾中生精细胞发育正常，且精子参数相对正常。这些数据表明Spmip8基因对于小鼠精子发生和雄性生育力是非必需的。近期研究已鉴定出超过60种修饰精子双微管的蛋白质，其中包括14种SPMIP蛋白。值得注意的是，Spmip家族成员主要在哺乳动物精子细胞中表达。虽然部分成员（如SPMIP7）被认为与男性不育有关，但也有研究指出SPMIP6和SPMIP9并非雄性生育力所必需。在本研究中，研究人员通过详细的表型分析证实了SPMIP8缺失不会导致生精障碍或精子参数异常。更重要的是，Spmip8敲除后，其他Spmip家族成员（如Spmip1、Spmip2、Spmip3、Spmip7和Spmip11）的转录水平代偿性升高，这提示了Spmip家族成员间存在功能冗余，从而弥补了Spmip8缺失带来的影响。综上所述，本研究证明高度保守且睾丸特异性表达的Spmip8并非小鼠精子发生和雄性生殖能力的必需基因。这一结果为相关领域的研究者提供了重要参考，有助于避免重复研究，并引导科研人员聚焦于对睾丸发育和雄性生育力真正不可或缺的基因探索。
