综述：利用基于CRISPR的功能筛选解析癌症应激适应通路的功能性拆解

《Cancer Letters》：Unraveling Stress-Adaptation Pathways in Cancer: Functional Dissection Through CRISPR-Based Genetic Screens

　　

癌症细胞面临以缺氧、营养剥夺、内质网(ER)应激和氧化失衡为特征的恶劣微环境。为应对这些挑战，它们激活了一个相互关联的网络适应性通路，包括自噬、未折叠蛋白反应、代谢重编程和综合应激反应(ISR)，从而促进细胞存活、治疗抵抗、免疫逃逸和转移。基于CRISPR的功能基因组学已成为系统性拆解这些应激适应网络的强大策略，能够在多样化的背景下识别关键调节因子和脆弱性。在这篇综述中，研究人员首先总结了主要应激条件下的肿瘤进展，随后重点阐述了从全基因组功能缺失研究到单细胞和组合平台的CRISPR筛选策略如何揭示关键的应激调节因子。此外，文章进一步讨论了新兴工具、模型系统和转化前景，强调CRISPR技术与多组学、人工智能和先进临床前模型的整合如何重塑对应激生物学的理解，并指导新型治疗策略的开发。最后，文章探讨了这些新型拆解技术如何影响转化机会，特别是在将应激通路调节剂与免疫治疗和靶向治疗药物联合应用的背景下。

1. 引言

癌症细胞面临多层面恶劣的肿瘤微环境(TME)，并部署复杂的适应性反应以维持生存和进展。这些反应包括缺氧下的代谢重编程、内质网(ER)应激期间的未折叠蛋白反应(UPR)激活以及营养剥夺下的代谢灵活性。缺氧、ER应激和营养剥夺在TME中相互交织。缺氧通过抑制脯氨酰羟化酶稳定缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)，驱动代谢向糖酵解转变（Warburg效应），上调葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、己糖激酶(HK)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)和乳酸脱氢酶A(LDHA)等基因。糖酵解导致的乳酸积累和细胞外酸中毒(pH ～6.3–7.0)通过细胞外基质降解、细胞骨架重塑及Rho/粘着斑激酶(FAK)激活促进侵袭。同时，缺氧还通过硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)破坏二硫键连接和脂质去饱和，损害ER蛋白折叠，从而激活蛋白激酶RNA样ER激酶(PERK)/真核翻译起始因子2α(eIF2α)、肌醇需求酶1α(IRE1α)/X盒结合蛋白1(XBP1s)和激活转录因子6(ATF6)以恢复ER稳态。UPR组分可放大HIF-1α信号和血管内皮生长因子(VEGF)的产生，促进血管生成和肿瘤侵袭性。在营养缺乏条件下，癌细胞通过上调乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)和激活固醇调节元件结合蛋白(SREBP)信号转向替代碳源，而葡萄糖/谷氨酰胺的限制会损害蛋白折叠并启动UPR。营养耗竭还通过减少Rheb水平抑制雷帕霉素复合物1(mTORC1)的机制靶点，Rag GTPases和AMP活化蛋白激酶(AMPK)则提供了额外的营养和能量感应层。免疫介导的应激激活NF-κB、JAK-STAT和干扰素信号以促进免疫逃逸并对抗抗PD1免疫治疗，而治疗应激则触发ATM/ATR依赖性DNA损伤反应和NRF2-Keap1抗氧化通路以恢复稳态。这些应激适应通路构成了一个复杂的网络，通过动态调节蛋白质合成、代谢通路和免疫微环境，使癌细胞能够抵抗治疗、逃避免疫破坏并转移。

CRISPR/Cas9筛选提供了一种无偏倚、高通量的方法来识别关键基因和通路，使癌细胞能够在环境或治疗及环境应激下生存和适应。通过使用CRISPR技术将遗传扰动引入细胞，观察这些扰动对癌细胞应对特定应激条件能力的影响。该方法利用池化的CRISPR文库在全基因组范围内敲除、激活或抑制基因，然后施加选择性应激（包括药物治疗、代谢挑战和/或环境应激）以识别其缺失或激活影响细胞适应性或应激反应的基因。CRISPR筛选已有效识别出对肿瘤生长、进展、耐药性和免疫逃逸至关重要的基因。这些筛选揭示了条件必需基因，例如在PERK-eIF2α、HIF-1α或AMPK激活时所需的基因，如氧化磷酸化(OXPHOS)组分（例如NDUFS1、SDHC），这些基因在缺氧或酸性环境中生存至关重要，但在常氧条件下则非必需。此外，筛选还识别了缓冲蛋白毒性应激的非经典调节因子（例如ER应激中的KLF4-生存素）、氧化还原稳态和代谢灵活性，这些在正常条件下是不可见的，包括增强对TME应激适应的UPR调节剂。本综述旨在探讨CRISPR筛选技术如何识别癌症应激适应性反应的关键调节因子。

2. 癌症中的关键应激适应通路

2.1 自噬与溶酶体功能

自噬和溶酶体功能是癌症中关键的、依赖环境的应激适应通路，支持肿瘤存活、代谢灵活性和治疗抵抗。自噬包括巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬，其核心调节因子如ULK1启动自噬体形成（与ATG13、FIP200和ATG101一起），以及ATG5/ATG7驱动膜延伸和结合过程，这对货物降解至关重要。在早期肿瘤发生中，自噬可通过清除受损细胞器来抑制恶性肿瘤，但在已建立的肿瘤中，特别是那些携带RAS突变的肿瘤，自噬通过上游调节因子如mTORC1抑制和AMPK激活，在营养剥夺、缺氧和治疗应激下促进生存，并通过溶酶体降解和药物隔离帮助免疫逃逸和化疗抵抗。溶酶体途径不仅消化自噬货物，还调节细胞内pH值和代谢信号（通过mTORC1），进一步增强癌细胞的适应性。针对自噬-溶酶体轴的策略，包括溶酶体抑制剂如羟氯喹以及新兴的ULK1和其他自噬基因的特异性抑制剂，显示出前景，但由于自噬具有抑瘤和促瘤的双重作用，需要特定背景的应用。近期研究强调了转录调控（如TFEB）、TME影响和新调节因子如MPP7和MDH1，突出了该通路的复杂性及定制化癌症治疗的潜力。基于肿瘤背景，癌细胞可能规避自噬抑制甚至上调代偿通路，特别是核因子红细胞2相关因子2(NRF2)介导的抗氧化和蛋白稳态机制。这种适应暴露了新的脆弱性，如对蛋白酶体抑制剂的敏感性，这可能具有治疗可操作性。自噬超越了细胞保护，延伸至独特的自噬依赖性细胞死亡(ACD)通路，特别是在某些药理应激下。潜在的抗癌药物如Δ-9四氢大麻酚(THC)、脂质衍生物ABTL0812和银杏酸通过持续的神经酰胺在ER中积累并激活eIF2α-ATF4-TRB3轴（抑制AKT/mTORC1）、ER应激和TRIB3上调（抑制PI3K/AKT/mTOR）以及AMPK-ULK1-mTORC1调节，强力诱导导致癌细胞死亡的自噬。当溶酶体回收或线粒体完整性不堪重负时，持续的自噬流也会导致死亡。此外，核心自噬调节因子Beclin-1和AMBRA1充当肿瘤抑制因子；BECN1缺失和AMBRA1减少会破坏自噬并促进肿瘤发生，其中Beclin-1在III类PI3K复合物中指导自噬体成核，而AMBRA1通过c-myc稳定和Cyclin D降解将自噬与细胞周期控制联系起来。

2.2. ER应激与未折叠蛋白反应(UPR)

UPR是癌细胞利用以应对以缺氧、营养剥夺和蛋白毒性应激为特征的有害TME的关键适应性机制。UPR的核心是三个关键的ER膜传感器：IRE1α、PERK和ATF6。IRE1α通过剪接XBP1 mRNA被激活，产生一种强效转录因子，增强蛋白折叠和降解能力，从而促进肿瘤生长和转移。PERK通过磷酸化eIF2α减弱全局蛋白合成，同时选择性增加激活转录因子4(ATF4)的翻译，调节抗氧化反应、自噬和凋亡，支持癌细胞在恶劣条件下的生存并导致治疗抵抗。ATF6在激活后易位至高尔基体，在那里被切割成活性转录因子，上调伴侣蛋白和折叠酶以恢复ER功能。ER应激在癌症生物学中具有环境依赖的双重性。中度或短暂的ER应激激活适应性UPR通路（IRE1α、PERK、ATF6）通过恢复蛋白稳态和氧化还原平衡支持肿瘤生长。相反，慢性或过度的ER应激将这些通路转向促死亡输出。持续的PERK-eIF2α-ATF4信号诱导CHOP和TRIB3，下调抗凋亡BCL-2蛋白，上调BIM和PUMA，触发线粒体凋亡。长期的IRE1α激活诱导受控的IRE1依赖性衰变(RIDD)，损害蛋白合成并促进凋亡。这种从适应到终末的UPR转换决定了癌细胞在持续性缺氧、营养剥夺或化疗下的命运。各种ER应激诱导刺激激活UPR，并与自噬交叉促进自噬相关细胞死亡。持续的ER应激抑制AKT和mTORC1，从而促进自噬体形成和致死性自噬而非细胞保护的回收。靶向这些通路，包括传感器本身或其下游效应物，提供了一个有前途的治疗途径，以增敏肿瘤治疗并破坏癌细胞的适应。正在进行的持续研究探索抑制剂和联合疗法，以有效利用癌症中ER应激和UPR网络的脆弱性。

2.3. 氧化应激与氧化还原调节

癌症中的氧化应激以活性氧(ROS)产生与抗氧化防御系统之间的失衡为特征，癌细胞利用这一点进行生存和进展。肿瘤细胞由于遗传不稳定性、代谢失调和微环境因素（如缺氧）固有地经历升高的ROS，这促进了致癌信号和DNA损伤，但也施加了细胞毒性氧化应激。为了适应，癌细胞上调关键抗氧化调节因子如NRF2，其控制谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等解毒酶的表达，维持氧化还原稳态。转录因子包括p53、FOXO和BACH1调节氧化应激反应，影响DNA修复、凋亡和代谢重编程。致癌通路如RAS通过NADPH氧化酶如NOX4增加ROS，引发DNA损伤反应，这些反应被精细平衡以利于肿瘤发生。这种适应性氧化还原调节通过调节信号级联和抑制过量ROS诱导的细胞死亡，促进细胞增殖、对化疗和放疗的抵抗以及转移。靶向这些适应性调节因子，特别是NRF2-Keap1轴和氧化还原敏感的转录网络，提供了有前途的治疗途径。然而，ROS作为信号分子和诱导致死损伤的双重作用，需要复杂的策略来破坏癌细胞的氧化还原适应而不伤害正常组织。近期研究强调了对肿瘤氧化还原生物学的特定背景理解，以优化靶向ROS的疗法并克服癌症中的治疗抵抗。

2.4. 代谢适应（糖酵解、脂质代谢、谷氨酰胺依赖性）

癌细胞通过上调糖酵解、脂质代谢和谷氨酰胺依赖性来重编程其代谢以支持应激下的快速生长。关键糖酵解调节因子包括作为主要葡萄糖转运蛋白促进葡萄糖摄取增加的GLUT1；特别是HK2，其磷酸化葡萄糖将其捕获在细胞内；PDK1，其抑制丙酮酸脱氢酶以减少丙酮酸进入TCA循环，从而有利于糖酵解而非线粒体氧化；以及LDHA，其将丙酮酸转化为乳酸再生NAD+以维持糖酵解。这些酶主要由HIF-1α上调，在缺氧下通过抑制脯氨酰羟化酶结构域蛋白2(PHD2)稳定，从而实现持续的糖酵解通量和适应低氧。RAS驱动的肿瘤通过激活巨胞饮（一种对营养缺乏的适应性代谢反应）来内化细胞外蛋白质和脂质，然后在营养缺乏（尤其是谷氨酰胺剥夺）下由EGFR/Pak1信号驱动降解为氨基酸和脂肪酸用于代谢。RAS-PI3K和mTOR信号通路调节巨胞饮以支持肿瘤生存和生长的代谢重编程。在脂质代谢中，癌细胞利用酶如ACSS2，将乙酸盐转化为乙酰辅酶A，特别是在营养耗竭或缺氧下为脂质合成提供燃料。Rho/FAK信号通路还促进脂质代谢适应和细胞运动，整合细胞外基质信号以支持癌症进展。这些调节因子维持生物能量学、氧化还原平衡和生物合成，促进生存、增殖和治疗抵抗。靶向这一网络，包括糖酵解酶GLUT1、HK、PDK1、LDHA，通过ACSS2进行的脂质代谢，以及氧化还原/缺氧传感器如PHD2，为破坏癌症代谢和克服抵抗提供了战略途径。SREBPs是控制脂肪酸和胆固醇生物合成的主转录因子。其激活依赖于 escort 蛋白SCAP（SREBP切割激活蛋白），后者感知内质网甾醇水平并将SREBPs转运至高尔基体进行蛋白水解激活。在癌症中，致癌信号（如PI3K/AKT/mTORC1）增强SCAP-SREBP活性，从而刺激脂肪生成、膜生物合成和肿瘤生长。该通路的失调支持代谢应激下的增殖，代表了潜在的治疗脆弱性，因为药理学或遗传学抑制SCAP可损害脂质合成并抑制肿瘤进展。除了经典的脂质调节因子如ACSS2或SREBP外，其他酶也塑造肿瘤脂质代谢并提供可操作性的代谢重构靶点。值得注意的是，鞘脂代谢酶包括神经酰胺合酶、鞘磷脂酶和鞘氨醇激酶，整合了代谢和应激信号。神经酰胺/S1P平衡控制癌细胞存活与死亡，将脂质代谢与自噬、凋亡和治疗抵抗联系起来。此外，靶向鞘脂酶的治疗潜力（要么激活产神经酰胺酶，要么抑制S1P产生酶如SPHK）将鞘脂调速器转向肿瘤抑制。

2.5. 综合应激反应(ISR)：eIF2α与ATF4轴

癌症中的综合应激反应(ISR)是一种关键的适应性机制，使肿瘤细胞能够在包括营养剥夺、缺氧和致癌信号在内的多种应激中生存。ISR的核心是应激反应性激酶对eIF2α的磷酸化，这在全球范围内减少了帽依赖性蛋白合成，在应激下节约资源，同时选择性地上调特定mRNA。一个关键靶点是转录因子ATF4，它协调参与氨基酸代谢、氧化还原稳态、自噬和凋亡调控的基因表达。通过ATF4，癌细胞动态重编程其蛋白质组以增强生存、维持细胞稳态并促进治疗抵抗。ATF4与CHOP共同决定应激下癌细胞的命运。两者均在PERK-eIF2α信号下游激活，并在转录上诱导TRIB3，这是一种假性激酶，可负向调节AKT并抑制mTORC1活性。这种抑制促进自噬，并且在持续应激下可导致自噬介导的癌细胞死亡。因此，ISR通过调节对环境损伤的翻译反应，在适应与死亡之间精细平衡细胞命运。此外，ISR驱动的致癌基因如MET的翻译促进了侵袭性生长和转移，强调了其在恶性肿瘤进展中的作用。在治疗上，靶向ISR-eIF2α-ATF4轴提供了一个有前途的策略来破坏癌细胞的可塑性和克服抵抗，因为该通路在翻译水平上整合应激信号以调节肿瘤生物学。

3. CRISPR筛选策略解析应激通路

3.1 应激研究中使用的筛选类型

CRISPR筛选文库旨在通过三种主要策略系统地干扰基因功能：功能丧失（CRISPR敲除，CRISPRko）、功能获得（CRISPR激活；CRISPRa）和转录抑制（CRISPR干扰；CRISPRi）。这些方法依赖于递送至细胞群体的单向导RNA(sgRNA)，其中每个sgRNA靶向特定基因进行编辑或调节。在池化筛选中，选择性应激前后sgRNA的相对丰度揭示了其缺失或激活影响特定表型的基因。在CRISPRko系统中，活性Cas9核酸酶在靶位点产生双链断裂，通过易错的非同源末端连接(NHEJ)修复，引入移码突变从而废除蛋白功能。CRISPRi采用催化失活的Cas9(dCas9)融合转录抑制因子，最常见的是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。当定向到启动子或增强子区域时，dCas9-KRAB招募染色质修饰复合物如KAP1、SETDB1和组蛋白去乙酰化酶，促进H3K9三甲基化和转录沉默，而不改变基础DNA序列。相反，CRISPRa使用dCas9融合转录激活因子来上调内源基因表达。两种主要的CRISPRa系统被广泛使用：协同激活介质(SAM)复合物，其采用dCas9-VP64结合MS2标记的sgRNA招募p65和HSF1激活结构域；以及SunTag系统，其中dCas9融合重复的GCN4肽阵列结合多个scFv-VP64分子，放大转录激活。这些互补平台允许在整个基因组中系统性地扰动功能丧失和功能获得状态，从而在各种应激条件下更全面地理解基因调控网络。

3.2 选择策略

3.2.1 代谢应激或药物暴露下的剔除筛选

CRISPR剔除(ko)筛选已演变为通过利用多种先进技术并与多组学整合来剖析代谢应激或药物暴露下的应激通路的复杂平台。通过分析剔除靶向应激适应性基因的sgRNA，结合下一代测序和生物信息学，可以识别关键的生存调节因子。例如，SPLiCR-seq（单细胞扰动连锁CRISPR测序）是一种单细胞多组学方法，将CRISPR介导的扰动与同一细胞中的转录组谱相关联。在这种方法中，每个细胞接收定义的sgRNA，条形码测序允许直接将扰动身份与其转录谱联系起来。SPLiCR-seq提供对未折叠蛋白反应(UPR)期间RNA剪接调节的直接高通量测量，揭示了影响IRE1-XBP1信号传导的新型调节因子如GADD34，这与细胞应激适应和免疫治疗疗效相关。将CRISPR筛选与类器官和微流控芯片器官模型相结合增强了生理相关性，并在复杂环境中揭示了基因功能。空间转录组学与CRISPR筛选的结合揭示了应激反应中的细胞异质性和微环境影响，产生了组织内脆弱性基因的空间图谱。CRISPR-Cas9扰动使用编码独特分子标识符(UMIs)或条形码的池化病毒文库递送至类器官或肿瘤异种移植物内的细胞。在允许表型显现足够时间后，空间转录组学平台如10x Genomics Visium或Slide-seq捕获局部转录组以及识别每个扰动的条形码序列。Perturb-FISH检测组织切片中扩增的sgRNA序列，允许将每个扰动的身份映射到相同的空间背景中的相应转录谱。这保留了在批量或解离细胞读数中所丢失的空间关系和异质性。使用核哈希（一组短的、唯一序列标记的寡核苷酸）实现高度复用的扰动筛选，通过单细胞RNA-seq读出，能够并行测量数千种扰动的转录反应。在scRNA-seq后，分析每个细胞内源性转录本的计数，而哈希标签计数（附加到哈希寡核苷酸的UMIs）用于将每个细胞分配到其扰动条件。这项工作建立了sci-Plex框架，将扰动与单细胞分辨率的转录组读数相结合，这对于在异质系统中解释大规模扰动文库高度相关。CRISPR介导的转录激活因子或抑制因子能够动态控制应激相关基因表达，促进超越敲除表型的机制拆解。在癌症中，剔除筛选突出了药物暴露下的代谢重构。例如，糖酵解酶抑制剂增敏肿瘤对化疗，并揭示合成致死伙伴以克服抵抗。

3.2.2 正选择筛选

正选择CRISPR筛选富集了那些缺失或改变赋予应激下抵抗或生存优势的sgRNA，从而能够稳健识别应激反应网络内的保护因子和调节因子。在这些分析中，将池化的CRISPR-Cas9或CRISPRi/a文库引入细胞群体，随后暴露于选择压力下。携带促进抵抗或适应的扰动的细胞将存活并富集，对幸存群体的sgRNA条形码进行测序揭示了介导该表型的候选基因。与检测对生存必需基因的负选择筛选相反，正选择筛选揭示了驱动治疗抵抗、代谢重构或癌细胞应激耐受的获得性功能或功能丧失适应。例如，正筛选已发现氧化损伤的关键调节因子、癌症信号通路中的耐药机制，如KEAP1以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MTOR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中的基因调节对激酶抑制剂的敏感性。这些筛选确定了其缺失赋予对ER应激诱导的凋亡的抗性或致敏性的基因。例如，UFMylation（泛素折叠修饰）通路的组分被发现促进保护性未折叠蛋白反应，而特定基因如SEC24A被确定为对毒胡萝卜素诱导的ER应激敏感性的关键介质。

3.3 读数类型

3.3.1 基于报告基因的读数

基于筛选的报告基因通过将CRISPR介导的基因扰动与荧光读数相结合，实现对自噬流和UPR等应激反应的实时监测。例如，LC3-GFP作为自噬流报告基因，通过自噬体和溶酶体中差异荧光实现自噬的动态定量，促进通过全基因组CRISPRko筛选识别关键自噬调节因子。修饰的报告基因如pHluorin-LC3-mCherry已被用作功能读数以提高对溶酶体pH变化的敏感性，增强自噬流和调节因子的检测。Tung等人开发了CHO-K1细胞中的双重未折叠蛋白反应(UPR)报告系统，以特异性拆解ATF6α信号的调节。该报告系统包括一个ATF6α依赖的BiP::sfGFP荧光报告基因和一个IRE1依赖的报告基因，能够同时监测两个主要的UPR分支。钙网蛋白(CRT)，一种ER腔内伴侣蛋白，被确定为选择性抑制因子，其缺失导致BiP::sfGFP ATF6α报告基因组成型激活（绿色荧光增加）、BiP水平升高以及加速的ATF6α运输和加工。在用于研究UPR的多路复用单细胞CRISPR筛选平台中使用的mCherry报告基因作为IRE1α激活的转录读数。在K562细胞系中，mCherry表达由响应剪接的XBP1(XBP1s)的UPR元件(UPRE)序列驱动，这是IRE1α信号的下游效应物。在ER应激和IRE1α激活后，内源性XBP1 mRNA被剪接，进而激活mCherry报告基因转录，导致红色荧光增加。

3.3.2 应激条件下的活力筛选

CRISPR筛选策略通过系统地扰动基因并评估其在应激适应和生存中的作用，为拆解细胞应激通路提供了强有力的途径。这些池化的CRISPR筛选采用全基因组或聚焦的sgRNA文库导入细胞，随后进行应激暴露。应激前后sgRNA丰度的下一代测序揭示了其破坏导致活力降低或增强的基因，从而聚焦于必需的应激反应调节因子。进展包括使用CRISPRi和CRISPRa以比敲除更微妙的方式调节基因表达，允许功能性询问必需基因，识别化学治疗应激下的关键调节因子（如TAF6L）。在昆虫细胞中进行全基因组CRISPR筛选，以确定极端寒冷（4°C）和炎热（30°C）下细胞生存所需的基因。通路分析显示寒冷应激富集RNA蛋白加工基因，热应激富集脂肪酸生物合成，证明了生物膜脆弱性和代谢适应对温度极端生存至关重要。在人类细胞系暴露于过氧化氢的筛选中，鉴定出LGALS2作为氧化应激诱导的细胞死亡的抑制剂，并强调了USP17和UTG家族基因，当其被破坏时会增加脆弱性。还揭示了额外的保护因子，如MT1G和MIR320C2，为氧化还原调节和潜在治疗靶点提供了见解。

3.4 实验分辨率

3.4.1 全基因组文库

整合的下一代文库如Brunello、GeCKO v2和作为癌症依赖性图谱(DepMap)一部分的Avana，现在提供增强的基因组覆盖率和更高的靶向效率，作为大规模发现的主要平台，先于聚焦或定制筛选策略。Avana文库筛选通常涉及以低感染复数(MOI, ～0.3)感染癌细胞，确保大多数为每个细胞一个sgRNA，随后进行嘌呤霉素选择。对于应激适应，细胞暴露于应激如线粒体抑制剂（如鱼藤酮）或化疗药物（如厄洛替尼）。文库包含约70,000个sgRNA靶向约18,000个基因，每个基因有多个引导。在早期和晚期时间点收获细胞，提取基因组DNA，并通过深度测序量化sgRNA代表性。数据标准化和每个引导的对数倍数变化相对于基线计算，随后进行基因水平评分，以识别在不同癌细胞系中对缺氧、氧化应激或药物治疗下的应激耐受性和生存至关重要的调节因子。Brunello和GeCKO v2文库遵循类似的协议，优化了每个基因的多个sgRNA，强烈强调保持高覆盖率（每个sgRNA约500个细胞）、重复感染和严格的统计管道（如BAGEL2, CHRONOS）。

3.4.2 定制文库

CRISPR筛选通过利用靶向激酶、自噬调节因子和其他通路特异性基因集的定制文库，彻底改变了细胞应激通路的拆解。通过利用全基因组或聚焦亚文库，研究人员实现了系统的基因候选基因敲除或修饰，以解开对应激适应至关重要的调控网络。多重组合CRISPR文库——在同一细胞中同时扰动两个或多个基因，使用编码成对或多重sgRNA的文库（每个sgRNA或成对带有唯一条形码）——如通过3Cs多重化创建的那样，允许同时研究数千个基因对（在一个实例中，使用247,032个成对sgRNA研究12,736个自噬基因组合）在应激反应网络内的协同、补偿和合成致死相互作用。靶向激酶和自噬调节因子的定制文库揭示了旁系同源家族间的调控冗余，如ATG2A-ATG2B和GABARAP-MAP1LC3B对。其他受限的定制CRISPR文库，如靶向1,530个人类脂质代谢基因，使得在Fidelito等人的研究中识别关键酶依赖性，突出了甲羟戊酸-多萜醇-N-聚糖生物合成通路和NUS1在维持前列腺癌细胞生存和生长中的核心功能。这些定制文库与基于荧光的报告基因等先进读数相结合，实现了对癌症应激适应机制的系统性、高分辨率探索，并揭示了针对治疗抵抗或代谢可塑性的可操作靶点。

3.4.3 单细胞CRISPR筛选解析应激的转录反应

通过将CRISPR介导的遗传扰动与单细胞RNA测序(scRNA-seq)相结合，研究人员可以剖析涉及应激适应的复杂细胞异质性和调控网络。在体内的表皮细胞中，单细胞CRISPR筛选精确定位了支持干细胞增殖和调节对不同应激源的转录组范围适应性反应的小蛋白。Perturb-seq能够对涉及ER稳态的基因进行功能性聚类，揭示不同的遗传扰动选择性激活特定