综述：将光合蓝细菌工程化作为生产植物来源生物活性萜类化合物的可靠平台

《Chemical Engineering Journal》：Engineering phototrophic cyanobacteria as a robust platform for production of plant-derived bioactive terpenoids

　　

冯辉成|谭春林|郑向梅|余欣|乔纳森·格申松|李胜宏|刘燕

中国西南中医药资源国家重点实验室，成都中医药大学中药与制药创新研究所，成都611137，中华人民共和国

摘要

萜类化合物（也称为异戊二烯类化合物）是生物活性天然产物中最大且结构最多样的一类，在医药、食品、化妆品和生物能源领域具有广泛的应用。然而，从植物中大规模提取生物活性萜类化合物受到其低固有产率和有限、不可持续性的植物资源的限制。通过合成生物学开发高效微生物细胞工厂已成为一种有前景且可持续的萜类化合物生产替代方案。蓝细菌作为一种光自养原核生物，能够利用阳光和二氧化碳（CO₂），天然具备合成萜类前体化合物的甲基赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径，这使它们成为可持续萜类生物合成的理想微生物底盘。本文总结了蓝细菌萜类化合物生物合成的最新进展，指出了限制高效萜类化合物合成的关键瓶颈，并讨论了提高萜类化合物产量的前沿合成生物学策略，包括基于CRISPR的基因编辑、RNA干扰（RNAi）、合成微生物联合体、酶工程和系统代谢工程。这项工作旨在为开发高性能蓝细菌细胞工厂提供有益的见解，最终促进基于萜类的生物活性化合物及其他高附加值天然产物的可持续生物合成。

引言

萜类化合物（或异戊二烯类化合物）是天然产物中最大且结构最多样的一类，迄今为止已鉴定出超过95,000种化合物[1]。除了介导植物间的相互作用和植物与环境之间的相互作用外，萜类化合物还表现出显著的生物活性（如抗炎、抗癌、抗氧化作用）和多种性质，使其在医疗保健、香料、化妆品、消毒剂和精细化学品中不可或缺[2]。从结构上讲，所有萜类化合物都由C₅异戊二烯单元组成，并根据其核心结构中的异戊二烯单元数量进行分类[3]：半萜类（C₅）、单萜类（C₁₀）、倍半萜类（C₁₅）、二萜类（C₂₀）、倍半萜（C₂₅）、三萜类（C₃₀）、四萜类（C₄₀）等。当前的生物制造研究主要集中在单萜类到四萜类化合物上，例如抗疟疾倍半萜青蒿素[4]、抗癌二萜紫杉醇[5]、抗氧化四萜番茄红素[6]，以及具有风味的倍半萜广藿香醇[7]和薄荷醇[8]。

萜类化合物的生产目前依赖于三种主要途径：植物提取、化学合成和微生物生物合成。传统的植物提取方法产量低、成本高，无法满足大规模需求，并且受到季节性和地域性的限制[9]；例如，从生长缓慢、再生能力差的Taxus树中提取紫杉醇本质上是不可持续的[10]。天然萜类化合物的化学合成受到差的选择性的影响，常常产生异构体混合物，从而增加了目标化合物纯化的复杂性[11]。相比之下，微生物发酵提供了一种高效且环保的替代方案，利用了微生物的短生命周期和高生产力[12]。因此，通过合成生物学构建用于萜类化合物生产的微生物细胞工厂已成为一种具有成本效益和可持续性的策略。

蓝细菌，也称为蓝绿藻，是一种以二氧化碳（CO₂为主要碳源并进行光合的自养原核生物。近年来，包括Synechococcus elongatus PCC 7942、S. elongatus PCC 11901、Synechocystis sp. PCC 6803以及快速生长的S. elongatus UTEX 2973在内的多种菌株已被广泛用于萜类化合物的生物合成[13]。与传统的异养底盘（如大肠杆菌、酿酒酵母）相比，蓝细菌具有一系列不可替代的特性，使其成为可持续萜类生物合成的更理想的底盘。与大肠杆菌和酿酒酵母不同，后者依赖昂贵的有机碳源（如葡萄糖、甘油）并在发酵过程中产生净二氧化碳（CO₂排放[14]，而蓝细菌可以直接固定大气中的二氧化碳（CO₂）并将太阳能转化为萜类化合物，实现了与全球低碳发展目标一致的碳负生物制造（图1）[15]。对于前体供应，蓝细菌内源性具备甲基赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径，该途径能够稳定合成萜类前体异戊二烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）[16]。相比之下，异养宿主通常需要异源表达6-基因甲羟戊酸（MVA）途径，这会带来显著的遗传和代谢负担[17]。一个特别值得注意的优势是蓝细菌与真核细胞色素P450（CYP450）酶的兼容性——这是萜类化合物结构多样化所必需的——而在其他微生物宿主中这些酶存在功能限制：大肠杆菌缺乏固定膜结合的CYP450的内源性骨架，需要外源电子传输系统，但其催化效率较低[18]，而酿酒酵母的细胞内NADPH水平不足，无法支持CYP450介导的氧化[19]。相比之下，蓝细菌丰富的类囊体膜为异源CYP450提供了内源性固定位点，其光合电子传输链通过铁氧还蛋白（Fd）-铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶（FNR）系统提供足够的NADPH以支持CYP450的催化[20]。例如，在Synechocystis sp. PCC 6803中功能性表达植物来源的对香豆酸-3-羟化酶（C3H）在光自养培养条件下产生了约7.2毫克/升的咖啡酸，而在大肠杆菌中进行类似实验则需要构建模拟膜的支架来恢复酶活性[21]。此外，为模型蓝细菌菌株开发了一系列先进的合成生物学工具，包括CRISPR-Cas9基因编辑、光响应启动子和小RNA（sRNA）介导的调控，从而实现了萜类途径的精确和可扩展的代谢工程[[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]]。综上所述，这些特性使蓝细菌成为可持续生产结构多样、高价值萜类化合物的理想且独特的底盘，其性能优于并补充了传统异养宿主的能力。

在这篇综述中，我们全面总结了通过酶工程和代谢工程在蓝细菌中萜类化合物生物合成方面的进展，重点介绍了关键工程策略，并详细说明了不同蓝细菌菌株产生的萜类化合物及其衍生物的产量（表1）。我们还讨论了蓝细菌萜类化合物生物合成的未来发展方向，结合了基因编辑、合成微生物联合体和代谢网络重构的最新突破，以指导未来的研究。我们认为，整合最先进的合成生物学策略将释放蓝细菌在萜类化合物生产中的潜力。

章节片段

蓝细菌萜类化合物生产的主要挑战

蓝细菌是萜类化合物生产的理想可持续宿主，因为它们可以利用阳光直接将二氧化碳（CO₂转化为萜类化合物[15]。然而，它们的工业应用仍受到碳分配效率低的限制。一个主要瓶颈是，在蓝细菌中（例如Synechocystis sp. PCC 6803），超过80%的光合固定的碳被用于生物质代谢，只有约5%用于萜类化合物代谢（包括类胡萝卜素、叶绿素等）[

萜类合成酶的功能表达

萜类合成酶（TPSs）是异源蓝细菌萜类细胞工厂发展的主要限制因素。核心瓶颈包括两个因素：异源表达效率低和对蓝细菌宿主的催化适应性差[20]。为解决这些瓶颈，当前的研究集中在两个互补的方向：TPSs的酶级工程和表达的调控优化，如图2所示。

合成微生物联合体合作

在扩大异源蓝细菌萜类细胞工厂规模的过程中，基于单一菌株的代谢工程常常面临代谢网络内在的刚性限制，例如前体供应不足、氧化还原不平衡以及对复杂多步骤萜类合成途径的适应能力差[93]。构建以蓝细菌为中心的合成微生物联合体——整合蓝细菌的光合碳固定能力

蓝细菌基因编辑工具的开发与应用

作为光自养底盘微生物，蓝细菌在代谢工程中面临的一个核心瓶颈是可用的遗传操作工具适应性差[102]。它们多倍体的基因组导致传统同源重组效率低，大大延长了获得纯合菌株的筛选时间。例如，一个Synechocystis sp. PCC 6803细胞可以携带多达53个染色体拷贝[104]。因此，精确调控复杂

结论与未来展望

蓝细菌作为一种能够直接利用二氧化碳（CO₂和太阳能的光自养底盘，已通过合成生物学得到改造，能够合成植物来源的生物活性萜类化合物（如柠檬烯、紫杉二烯），显示出它们作为传统植物提取和化学合成替代方案的潜力。先进的合成生物学工具，包括CRISPR-Cas系统（Cas9/Cas12a用于靶向基因编辑，Cas3用于大片段编辑

CRediT作者贡献声明

李胜宏：资金获取、撰写——审阅与编辑。郑向梅：撰写——审阅与编辑。乔纳森·格申松：撰写——审阅与编辑。余欣：撰写——审阅与编辑。刘燕：撰写——审阅与编辑。谭春林：撰写——审阅与编辑。冯辉成：撰写——原始草稿。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢所有在本文中被引用或未能被引用的同事。对于因字数和引用限制而未在此提及的重要工作的作者，我们表示歉意。本工作得到了国家自然科学基金（32400068, 82222072）和四川省自然科学基金（2024NSFSC1833）、中国博士后科学基金（GZC20230332, 2024M750284, 2025T180738）以及四川省创新人才资助的支持