鉴定CBFA2T3::GLIS2急性髓系白血病的靶向治疗策略

《Leukemia》：Identifying targeted therapies for CBFA2T3::GLIS2 acute myeloid leukemia

　　

CBFA2T3::GLIS2阳性的儿童急性髓系白血病（AML）仍然是最具不良预后的AML亚型之一。为了揭示该疾病亚型创新的靶向治疗方法，研究人员进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，结果显示与其他类型的癌症相比，该亚型对JAK2表现出强烈且选择性的依赖性。利用多西环素诱导的JAK2敲除（KO）系统，研究人员在CBFA2T3::GLIS2细胞系中验证了JAK2的依赖性，观察到体外和体内增殖受损以及体外凋亡诱导。I型（ruxolitinib）和II型（CHZ868）JAK2抑制剂在CBFA2T3::GLIS2阳性AML模型中均显示出选择性的体外活性。为了确定JAK2抑制剂的耐药性和增敏机制，研究人员在CBFA2T3::GLIS2 AML中使用了CRISPR-Cas9 ruxolitinib锚定筛选。在ruxolitinib处理的细胞中，靶向MAPK通路负调控因子的sgRNA富集。同样，在长期ruxolitinib治疗下生长至耐药的CBFA2T3::GLIS2 AML亚系表达了致病的NRAS突变。两种方法均指向MAPK通路激活是ruxolitinib治疗的耐药机制。将ruxolitinib与MEK抑制剂联用在表达该融合蛋白的细胞系和患者来源的异种移植（PDX）细胞中显示出协同效应，并在CBFA2T3::GLIS2 AML PDX体内显示出活性，表明这是一种靶向该预后不良AML亚型信号传导通路的潜在方法。

研究背景与立论依据

急性髓系白血病（AML）约占儿童白血病的25%，其中急性巨核细胞白血病（AMKL）作为一种亚型，约占儿童AML的10%。在非唐氏综合征相关的AMKL（non-DS-AMKL）中，预后尤为恶劣，总体生存率仅为14%至34%。染色体16的倒位inv(16)(p13.3q24.3)导致CBFA2T3与GLIS2基因融合，这是non-DS-AMKL中最普遍的染色体异常（约20%的患者）。CBFA2T3::GLIS2融合蛋白通过结合增强子和其他调控元件改变转录程序，导致分化阻滞和自我更新能力增加。尽管该亚型具有独特的生物学特性，但目前患者仍采用与其他高危AML相同的治疗方案，缺乏针对性的治疗手段。由于直接靶向融合转录因子具有挑战性，研究人员旨在通过功能基因组学手段寻找该亚型特异的依赖基因，从而发现可成药的靶点。该研究最终发表于《Leukemia》杂志。

关键技术方法概述

本研究主要采用全基因组CRISPR-Cas9筛选技术，利用Broad Institute的Cancer Dependency Map（DepMap）数据及自主开展的基因组规模筛选，鉴定关键依赖基因。利用多西环素诱导的JAK2敲除系统验证基因依赖性。通过建立ruxolitinib耐药细胞株及体内外药物修饰筛选探究耐药机制。采用Chou–Talalay中位效应模型计算联合指数（CI）评估药物协同作用。利用患者来源的异种移植（PDX）模型在体内验证单药及联合用药疗效。临床样本分析则基于TARGET AML队列的RNA测序数据进行基因集富集分析（GSEA）。

研究结果

CRISPR-Cas9筛选确定JAK2是CBFA2T3::GLIS2 AML中的强选择性依赖

通过对DepMap数据库及WSU-AML等三个融合阳性细胞系的分析，研究人员发现JAK2和JAK1是共享的依赖性基因。鉴于JAK2评分更高，研究人员利用多西环素诱导的敲除系统证实了JAK2的缺失会显著抑制三种CBFA2T3::GLIS2 AML细胞系的增殖，并诱导细胞凋亡，而对细胞周期分布和分化无明显影响。

JAK2缺失损害体外活力并诱导凋亡

功能实验进一步证实，JAK2敲除导致下游信号分子STAT3和STAT5磷酸化水平降低，显著抑制细胞生长，并增加了Annexin V阳性细胞的比例，确立了JAK2在该亚型中的生存必需性。

JAK2是AML体内进展所必需的

在WSU-AML细胞构建的NSGS小鼠异种移植模型中，诱导JAK2敲除显著降低了骨髓、脾脏和外周血中的白血病负荷，减小了脾脏重量，并延长了小鼠的生存期。虽然在研究终点检测到编辑效率下降，提示体内存在对JAK2缺失的强选择压力，但该结果反向验证了JAK2对体内肿瘤维持的关键作用。

原发性患者CBFA2T3::GLIS2 AML富含JAK-STAT转录程序

对TARGET AML队列的RNA测序数据分析显示，CBFA2T3::GLIS2阳性样本相较于阴性样本，显著上调了TNF-α、IL2-STAT5、IL6-JAK-STAT3及JAK2-STAT信号通路。基因集富集分析（GSEA）及ssGSEA分析均证实，融合阳性样本中存在显著的JAK-STAT基因特征富集，且这种富集在M7谱系中最为明显。

CBFA2T3::GLIS2 AML对JAK2小分子抑制剂有反应

研究人员测试了I型JAK1/2抑制剂ruxolitinib、tofacitinib以及II型抑制剂CHZ868的疗效。结果显示，融合阳性细胞系对这两种类型的抑制剂均表现出比融合阴性细胞系更高的敏感性。在临床病例报告中，一名携带CBFA2T3::GLIS2融合及NRAS p.G12D突变的复发难治性患儿在接受ruxolitinib治疗后，外周血原始细胞数量减少并趋于稳定。此外，在多个PDX模型中也观察到了类似的药物敏感性。

全基因组CRISPR-Cas9筛选揭示MAPK通路激活是JAK2抑制的耐药机制

为了探寻耐药机制，研究人员在CMS和WSU-AML细胞系中进行了ruxolitinib修饰基因的CRISPR筛选。结果显示，在耐药性细胞中，靶向MAPK通路负调控因子（如RASA2、GOLGA7、LZTR1）的sgRNA显著富集。体外实验证实，RASA2敲除导致pERK和pMEK表达增加，并使细胞对ruxolitinib产生耐药性。

耐药细胞系的生成证明获得性NRAS突变是JAK抑制的耐药机制

通过长期暴露于递增浓度的ruxolitinib，研究人员建立了耐药亚系。基因分型分析发现，这些耐药亚系分别获得了NRAS p.G12R和p.G13D错义突变。信号通路分析显示，耐药细胞表现出磷酸化MEK和AKT的增加。重要的是，这些耐药细胞对MEK抑制剂trametinib表现出比亲本细胞更强的敏感性，提示发生了从JAK依赖到RAS-MAPK通路依赖的信号重编程。

JAK和MEK抑制联合改善CBFA2T3::GLIS2 AML的细胞毒性

鉴于MAPK通路激活是主要耐药机制，研究人员尝试联合阻断。体外实验显示ruxolitinib与trametinib或selumetinib联用具有协同效应。在体内实验中，利用携带CBFA2T3::GLIS2融合及NRAS突变的CPCT-0027 PDX模型，研究发现selumetinib与ruxolitinib联合治疗显著降低了骨髓和脾脏中的白血病负荷，并改善了小鼠的生存期。虽然ruxolitinib未能有效抑制体内的pSTAT5信号，但selumetinib显著抑制了pERK，证实了联合治疗的有效性。

结论与讨论总结

本研究通过系统的功能基因组学筛选，确立了JAK2是CBFA2T3::GLIS2阳性儿童AML的关键脆弱性靶点。尽管I型JAK抑制剂ruxolitinib在临床前模型和个案患者中显示出一定活性，但研究发现其耐药机制主要涉及MAPK通路的激活，具体表现为RASA2等负调控因子的丢失或获得性NRAS突变。针对这一耐药机制，研究人员提出了JAK2与MEK抑制剂联用的策略，并在体内外模型中验证了其协同增效作用。这一发现为克服单一疗法耐药、改善这种高危儿童AML亚型的预后提供了重要的理论依据和转化潜力。