《ACS Omega》：Universal Smartphone-Assisted Colorimetric Quantitative Platform Based on CRISPR Cas12a Detection for Sensitive and Rapid Diagnosis of Multiple Virulence Genes of Hypervirulent Klebsiella pneumoniae
引言
在过去的几十年里，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）在亚太地区的流行情况令人担忧，尤其与社区获得性化脓性肝脓肿相关。这种病原体的特点是多部位感染、高侵袭性和致病性，常导致严重后遗症。因此，有效区分hvKp与经典肺炎克雷伯菌（cKp）对于指导临床感染管理至关重要。关键毒力基因已被确定为hvKp毒力最可靠的分子标志物，能够准确区分hvKp和cKp。常见的用于区分hvKp的毒力基因包括rmpA、iroB、iucA和peg-344。rmpA基因是hvKp的核心生物标志物，调节荚膜多糖合成，从而增强细菌粘附、抗吞噬作用和生物膜形成。iroB基因是沙门菌素铁载体生物合成簇的一部分，介导铁获取。iucA基因是气杆菌素生物合成基因簇的关键组成部分，编码一种铁载体，促进细菌对铁的螯合。iroB和iucA的存在增强了铁获取——这是细菌生存和毒力的关键过程。peg-344基因编码一种位于内膜的转运蛋白，可增强肺炎克雷伯菌的生存和竞争适应性。此外，该基因对于细菌在肺部攻击模型中实现完全毒力是必不可少的。流行病学分析已证实，联合检测rmpA、iroB、iucA和peg-344对hvKp丰富人群中的hvKp鉴定诊断准确度大于0.95。传统的hvKp检测技术，如实时荧光定量PCR（qPCR）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），对于实际评估致病潜力过于繁琐。因此，迫切需要开发快速、用户友好、高灵敏/高特异性的针对多种hvKp毒力基因的即时诊断（Point-of-Care）技术。
近年来，基于CRISPR Cas，特别是CRISPR Cas12a的检测系统在诊断各种病毒和细菌方面获得了广泛认可。该系统减少了对实验室基础设施的依赖，并提供快速、易于解读的结果，其灵敏度可与实时PCR相媲美。科学家们已利用CRISPR Cas检测系统诊断耐药基因和毒力基因。例如，Xu等人创建了结合Cas12a和环介导等温扩增（LAMP）的侧流层析试纸条，可在1小时内识别碳青霉烯酶耐药基因KPC和NDM。Chao等人开发了一种基于Cas12a并结合重组酶聚合酶扩增（RPA）的方法，检测hvKp特异性标志基因peg-344和rmpA。这些研究突出了CRISPR-Cas系统在鉴定肺炎克雷伯菌耐药和毒力基因方面的潜在作用。
目前，这些测试主要依赖专业人员或昂贵设备，如荧光定量PCR仪和紫外分光光度计。然而，由于这些设备通常体积大、成本高，并且需要在资源有限的环境下监督使用，因此在此类环境中效果不佳。为了应对这一挑战，新兴的生物传感技术提供了传统方法的实用替代方案，并越来越受欢迎。通过将比色检测与智能手机等便携设备集成，这些系统为即时生化分析提供了简单、交互式的信息。
材料与方法
本研究中使用的高毒力肺炎克雷伯菌菌株SZ859、X22-3和FY-841来自实验室保存菌株。所有菌株均从临床标本中分离，并已确认分别携带毒力基因rmpA、iroB、iucA和peg-344。此外，从广东医科大学附属第一医院的患者中收集了几株肺炎克雷伯菌临床分离株（KP84844, KP84703, hvKP17104, hvKP69670）。所有菌株均在生物安全2级（BSL-2）实验室中处理。
菌株在37°C培养6-8小时，然后稀释至0.5麦氏浊度（MCF）单位。为了选择最合适的临床hvKp样本基因组DNA提取方法，使用了多种方法提取菌株基因组DNA：天根细菌DNA试剂盒、碱裂解法、热裂解法、PBS冻融法、纯水裂解法和异硫氰酸胍（GITC）裂解液提取法。通过DS-11系列分光光度计/荧光计测量细菌基因组DNA的浓度和纯度。
目标DNA片段rmpA、iroB、iucA和peg-344保存在实验室。携带LbCas12a基因的质粒pET28a来自吉林大学实验室保存菌株。重组酶辅助扩增（RAA）试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司。引物、单链DNA（ssDNA）报告基因和CRISPR RNA（crRNA）由生工生物工程（上海）股份有限公司和华大基因合成。
简要来说，用pET28a-Cas12a表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），并在补充有卡那霉素（25 μg/mL）的LB培养基中培养。然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度95 μg/mL。细菌在16°C培养16-18小时。采用亲和层析纯化Cas12a蛋白。纯化的Cas12a蛋白收集并使用30 kDa超滤膜管浓缩。通过SDS-PAGE分析凝胶过滤组分，并使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。使用缓冲液A（20 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM TCEP, 150 mM NaCl, 和50% (v/v) 甘油）储存纯化的Cas12a蛋白，并于-80°C保存。
为防止RNA降解，crRNA通过体外转录（IVT）获得。合成单链DNA寡核苷酸（包含靶序列及其互补序列）并退火形成双链DNA。然后使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit转录crRNA。产生的crRNA使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit纯化，使用DS-11系列分光光度计/荧光计定量，稀释至统一浓度1 μM，并于-80°C保存。
为优化反应体系，为每个毒力基因设计了三种不同的crRNA，每种靶向DNA的不同区域。根据相应荧光曲线的斜率选择最佳crRNA。还优化了crRNA（17.5, 35, 和70 nM）和Cas12a酶（15, 30, 和60 nM）的浓度。此外，发现加入RNase抑制剂会影响检测性能，并相应标准化了其浓度。最后，优化了荧光报告探针的浓度以最小化总反应时间。
对于检测实验，测试样品的基因组DNA首先使用RAA系统进行扩增。根据制造商说明在50 μL混合物中组装RAA反应，包含每种引物2 μL（10 μM），25 μL缓冲液A，2.5 μL缓冲液B，和5 μL样品基因组DNA，体积用无核酸酶水补足至50 μL。扩增过程在37°C进行20分钟。
最终的Cas12a-SACQP检测反应在50 μL体积中进行，包含25 μL RAA扩增产物，30 nM Cas12a，35 nM crRNA，300 nM ssDNA，2.5 μL 10×反应缓冲液，和1 U RNase Inhibitor, Murine。体积用无核酸酶水调整至50 μL。进行不含任何模板的阴性对照反应，反应在37°C于荧光计中孵育30分钟，每分钟监测一次荧光（激发：492 nm；发射：517 nm）。
为确定检测限，将基因组DNA从1 fM连续稀释至1 nM并进行分析。通过用非靶标DNA挑战评估CRISPR Cas12a辅助检测的特异性，同时使用包含多个毒力基因模板的混合物评估其抗干扰能力。所有反应均使用上述RAA-CRISPR–Cas12a方案进行。
为便于结果可视化，构建了一个便携式检测设备。外壳由黑色亚克力板制成，以最大限度地减少光干扰。顶部中心的圆形开口可容纳光学滤光片，使后置的智能手机摄像头能够捕获图像。内部，样品室由蓝色发光二极管（LED, 470 nm）从侧面照明。整个系统由移动电源供电，通过消除对固定电源适配器的需求来增强便携性。
为确保样品照明均匀，精确控制了每侧的光束数量和灯条之间的间距。此外，为了标准化不同智能手机型号的输出，使用荧光物质稀释系列（范围从2×10–5到2 μg/mL）对设备进行了校准。
开发了一个名为比色定量可视化检测平台（CQVIP）的创新快速病原体检测平台，以简化操作和数据分析。CQVIP是一个使用JavaScript和Python构建的微信小程序。其功能包括智能手机型号选择、图像采集、感兴趣区域（ROI）颜色提取、数据分析和历史数据检索。用户选择移动设备，上传样品照片，并定义ROI以获得分析结果——在本研究中，是RGB颜色模型中的绿色通道强度。该平台还生成拟合线和浓度散点图以可视化数据趋势。
为了评估CRISPR Cas12a检测的临床检测性能，首先通过使用热裂解法提取的基因组DNA确定其灵敏度。随后，使用临床分离株评估灵敏度，hvKp基因组DNA浓度范围为1.5×101到1.5×106CFU/mL。结果使用便携设备获取，数据处理使用CQVIP系统进行。此外，将已知量的通过热裂解提取的hvKp基因组DNA加标到五个唾液样本中。这些加标样本在双盲条件下制备，并在使用Cas12a-SACQP分析后计算准确率。
最终，我们使用几种临床分离株验证了Cas12a-SACQP系统。这些菌株，命名为KP84844、KP84703、hvKP17104和hvKP69670，是从不同患者的不同样本类型中分离得到的，并来自广东医科大学附属医院临床实验室。所有临床菌株均通过16S rDNA测序和MALDI-TOF MS确认为肺炎克雷伯菌。
为了比较不同临床样本类型中不同肺炎克雷伯菌菌株的各种检测方法，我们并行使用了三种方法：基因测序、qPCR和Cas12a-SACQP。使用热裂解法提取基因组DNA。对于基因测序，引物序列在补充材料表S3中给出。PCR反应混合物包含12.5 μL 2× Taq PCR MasterMixII，每种引物1 μL（10 μM），1 μL DNA模板，和无核酸酶水至终体积25 μL。反应在95°C进行60秒，随后进行35个循环：95°C 10秒，56°C 15秒，72°C 30秒。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，随后送至华大基因进行基因测序。对于qPCR检测，四个靶毒力基因的序列详见表S3。反应体系详情如下：10 μL Premix Taq，1 μL引物（3 μM），2 μL DNA模板，和无核酸酶水至20 μL。反应条件包括95°C变性3分钟，随后进行40个循环：95°C变性5秒，60°C退火40秒，72°C延伸60秒，最后在72°C延伸8分钟。
使用GraphPad Prism 9和Origin 2021进行数据分析和绘图。所有数据显示为平均值±标准差（SD）。检测限（LOD）基于公式3σ/斜率计算，其中σ代表三个对照样品测量的标准差。当仅比较两组时，使用t检验确定是否存在统计学显著性。显著性水平表示为*p < 0.05, p < 0.01,p < 0.001, 和***p < 0.0001。
结果
构建了用于检测hvKp毒力基因的基于CRISPR Cas12的智能手机辅助比色定量平台（Cas12a-SACQP）。工作原理如下：首先，提取细菌基因组DNA，并通过重组酶辅助扩增（RAA）进行特异性扩增，获得靶标双链DNA（dsDNA，橙色），而无模板（黑色）则无法被扩增和识别。当Cas12a-crRNA复合物识别靶标dsDNA后，Cas12a的反式切割活性被激活，无差别地降解反应体系内的ssDNA报告基因，产生荧光信号。该原理被整合到Cas12a-SACQP技术中用于细菌DNA检测。自定义开发的智能手机应用程序CQVIP自动分析结果。使用便携设备进行视觉检测的过程如图所示，补充图S1显示了整个内部结构的便携设备示意图。建立了将样品浓度与RGB值相关联的回归曲线。首先，调用CQVIP识别荧光图像，并根据RGB值绘制拟合曲线。该拟合曲线有效地将RGB值转换为样品浓度，从而能够对CRISPR Cas12a辅助检测产生的荧光信号进行定量分析。最后，将绿色通道RGB强度拟合到回归曲线以获得样品浓度，实现定量检测。总之，利用颜色变化来检测细菌DNA的浓度。
为建立细菌DNA检测系统，系统地优化了每个组件以最大化检测效率。关键因素是最佳crRNA的选择和Cas12a酶的酶活性，这显著影响检测系统的性能。首先，表达并纯化了LbCas12a酶（Lachnospiraceae bacterium ND2006），并证明其酶活性不劣于商业酶（图S2）。随后，为每个靶毒力基因设计了三种特异性crRNA。每种crRNA都包含了限制性内切酶LbCas12a特异性识别序列（TTTV），以靶向不同毒力基因的编码链。所选crRNA及其检测靶序列列于表S1和S2；筛选、检查并在实时荧光定量仪器上测试了十二种潜在的crRNA。根据结果，为rmpA、iroB、iucA和peg-344选择的最佳crRNA分别是rmpA-3-544（信噪比S/N = 2.91）、iroB-3-588（S/N = 7.01）、iucA-1-1155（S/N = 11.55）和peg-344-231（S/N = 2.93）。这些被选用于所有后续检测实验。
优化Cas12a与crRNA的比例是必要的，因为它关键地决定了检测性能。选择35 nM crRNA和30 nM Cas12a的组合，因为其背景荧光最小，并且能够显著区分荧光强度，信噪比为10.52。此外，加入RNase抑制剂以增强crRNA稳定性，并且这种加入产生了显著效果。我们监测了有和无RNase抑制剂情况下30分钟内的荧光强度变化，进一步分析显示，在30分钟时间点，使用RNase抑制剂的荧光强度增加了27.73%。此外，通过改变探针浓度（最终浓度范围100至500 nM）选择了系统的最佳反应时间，最终决定后续实验的切割时间为30分钟（图S3）。总之，25 μL检测系统包含缓冲液、crRNA（35 nM）、LbCas12a（30 nM）、ssDNA-FQ（300 nM）和RNase抑制剂（1 U）。
为了验证CRISPR/Cas12a辅助检测的可行性，使用携带hvKp毒力基因的质粒进行了初步实验。如图所示（图S4A-D），荧光强度随着DNA浓度的降低而降低。线性定量范围从1 fM到1 nM，毒力基因rmpA的方程为y = 318812log(x) – 445495（R2= 0.97），iroB基因为y = 255995log(x) + 48109（R2= 0.99），iucA基因为y = 354607log(x) – 77399（R2= 0.98），peg-344基因为y = 143827log(x) + 317028（R2= 0.98）。基于LOD = 3σ/斜率的计算，我们证明CRISPR/Cas12a辅助检测对hvKp毒力基因的检测水平达到0.1 fM。关于检测的特异性，如图所示（图3E），结果表明只有当特异性靶标和crRNA同时存在时，Cas12a介导的反式切割才会启动，这在所有四个基因中都是一致的。图3F证明了阳性结果和包含所有四个靶基因等浓度混合样品的信号读出的 一致性，强调了其强大的抗干扰能力，并验证了该检测系统的临床适用性。
为了检测hvKp菌株中的毒力基因，我们探索了各种快速细菌DNA提取技术，详见材料部分。这些方法包括热裂解、碱裂解、PBS冻融、纯水裂解以及使用GITC裂解液提取，并以TIANamp Bacterial DNA Kit作为阳性对照。最终，使用热裂解法提取hvKp菌株的基因组DNA，因为它是最方便的DNA提取方法（表S4）。将传代培养的hvKp菌株调整至光密度0.5 MCF（1 MCF = 1.5×108CFU/mL），并在1.5×101至1.5×106CFU/mL范围内进行系列稀释。荧光强度随着病原体基因组DNA浓度的升高而增加，如图S5A-D所示。
为了评估检测加标样品的临床适用性，我们通过将携带毒力基因的hvKp菌株引入阴性唾液样品中来制备加标样品。随后，将hvKp基因组DNA在1.5×101至1.5×106CFU/mL范围内以唾液为基质进行梯度稀释。随着浓度降低，观察到归一化荧光的剂量依赖性减少（图4A），并且在病原体基因组DNA的对数浓度与荧光强度之间发现了稳健的线性关系（图4B,C）。重要的是，所有基因的检测限均在一小时内达到，病原体基因组rmpA为2.42 CFU/mL，iroB为2.33 CFU/mL，iucA为1.72 CFU/mL，peg-344为2.83 CFU/mL。总体检测限为3 CFU/mL。此外，我们评估了Cas12a-SACQP平台针对各种菌株的特异性。如图4D-G所示，CRISPR-Cas系统选择性检测了携带毒力基因的肺炎克雷伯菌分离株，突出了其高特异性。结果表明基于CRISPR Cas12a的检测对hvKp多种毒力基因具有高灵敏度、高特异性和可行性，揭示了其在检测临床样品中的应用潜力。
为了证明CRISPR Cas12a检测hvKp多种毒力基因在即时检验中的可行性，设计了一个结合手机应用信号读出的便携设备，其内部光学布局如图5A所示，用户友好界面如图5B所示。使用智能手机摄像头拍摄照片并上传到名为CQVIP的手机应用。通过CQVIP执行的分析，我们获得了测试样品的RGB值及其相应的浓度信息。为了建立样品浓度与RGB值之间的关系，我们为此使用了回归曲线。该曲线有效地将RGB值转换为样品浓度值，从而能够对CRISPR Cas12a辅助检测产生的荧光信号进行定量分析。将RGB值输入回归曲线以获得样品浓度，实现定量检测（图5C）。
为了增强信噪比，优化了几个参数：LED灯条的数量、它们的垂直位置以及图像处理算法。这涉及应用阈值操作和形态学处理方法，利用均值滤波和双边滤波，来分离对应于最亮中心区域的ROI值。这种方法有效地消除了反光点，从而实现了更精确的检测。我们最终选择了“六控灯条-下方”组合在额定电压5V下，因为其便携性和高灵敏度优势（图S6；表S5）。此外，为了进一步最小化用户分析管内荧光数据时的潜在偏差，我们使用三个智能手机品牌进行了试验，并设定了一个检测阈值，该阈值设置为非靶标对照分析得出的平均像素强度加上三个标准差。如图S7所示，所有测试的智能手机品牌都获得了良好的信噪比。
优化实验条件后，我们使用“Cas12a-SACQP”评估加标样品的灵敏度。如图5D-G所示，荧光强度随着病原体基因组DNA浓度的增加而增加。在1.5×101至1.5×106CFU/mL范围内观察到病原体基因组DNA浓度与荧光强度之间的线性关系，并得到以下方程支持：病原体基因组rmpA为 y = 24.36log(x) + 65.27（R2= 0.98），iroB为 y = 23.85log(x) + 79.48（R2= 0.98），iucA为 y = 22.96log(x) + 70.82（R2= 0.97），peg-344
