《Analytica Chimica Acta》：Rapid Detection of Measles Virus RNA from Clinical Specimens by Using RT-LAMP Coupled with CRISPR/Cas12b via Fluorescence and Lateral Flow Biosensor Readouts: A Proof-of-Concept Study
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麻疹病毒快速检测技术LAmCaD：基于RT-LAMP与CRISPR-Cas12b的双模诊断平台研究，通过自纯化AapCas12b实现无需复杂设备的高特异性检测（灵敏度10^5 copies），适用于资源有限地区，助力全球麻疹消除。
作者：Shivani Sharma、Shibendra Kumar Lal Karna、Sudhir Khanal、Yuba Raj Pokharel
印度新德里南亚大学生命科学与生物技术学院
摘要
背景
快速确认疑似病例对于控制麻疹至关重要，但现有方法需要复杂的实验室设施。我们开发了一种名为LAmCaD的新型诊断平台，该平台结合了环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification）和CRISPR-Cas12b分子剪刀（CRISPR-Cas12b），集成了快速核酸提取、RT-LAMP扩增以及自纯化的AapCas12b蛋白，能够在缺乏实验室条件的环境中用于检测麻疹RNA。
方法
LAmCaD基于荧光和侧向流动生物传感器两种检测方式。使用Vero/hSLAM细胞培养的麻疹病毒RNA对LAmCaD方法的分析灵敏度和特异性进行了评估，并通过患者样本与标准RT-PCR方法进行了对比测试。同时，还评估了其对流行病学上重要的麻疹基因型D8、D4和B3的检测能力。
结果
来自Alicyclobacillus acidiphilus的自纯化蛋白AapCas12b具有强烈的顺式（cis）和反式（trans）切割活性，从而无需依赖商业酶制剂。该平台通过快速核酸提取直接使用临床样本，无需进行RNA纯化步骤，即可直接用于RT-LAMP反应。单独使用RT-LAMP的检测灵敏度约为10^3个拷贝，而整个检测流程可检测到约10^5个拷贝的麻疹病毒（通过荧光检测）或约10^4个拷贝的麻疹病毒（通过侧向流动检测）。诊断评估显示灵敏度为64.00%，特异性为92.59%，阴性预测值为99.95%，总体准确率为92.56%。ROC曲线分析显示AUC值为0.717，表明其具有较好的区分能力。该检测方法与RT-PCR的结果具有中等程度的一致性（κ = 0.6），并能成功识别D8、D4和B3基因型。整个检测过程耗时90分钟。
结论
这一概念验证性的LAmCaD平台为开发一种成本低廉、可在现场使用的诊断测试奠定了基础，无需依赖商业酶或复杂的样本处理流程。该平台有助于在资源有限或偏远地区快速确认麻疹病例，从而为全球消除麻疹的目标做出贡献。这项研究在世卫组织东南亚区域进行，尤其与该地区2023年的消除目标相关，有助于解决当前监测差距和样本运输挑战等问题。
部分内容摘录
引言
麻疹病毒（MeV）是一种单链负链RNA病毒，基因组大小约为15.9 kb，属于Paramyxoviridae科的Morbillivirus属。这种高度传染性的病原体会导致急性呼吸道疾病，具有较高的发病率和死亡率，主要感染人类，极少传播给非人类灵长类动物，通过空气传播，且没有已知的动物宿主。一个感染者可将其病毒传播给12-18人。
生物材料
本研究使用了两类样本：未经处理的临床样本（用于评估检测方法的性能及潜在的生物抑制剂和基质效应），以及人工制备的样本（如经过充分表征的对照样本和合成样本）。麻疹阳性临床样本、病毒分离株（基因型D8、D4和B3）以及rubella病毒分离株（基因型2B）均来自印度医学研究委员会-孟买国家病毒学研究所。
LAmCaD检测原理
该检测系统通过两阶段扩增和检测过程实现目标，结合了RT-LAMP的灵敏度和CRISPR-Cas12b的特异性。在第一阶段，RT-LAMP扩增使用六个引物（F3、B3、FIP、BIP、LF和LB），这些引物能够识别目标模板上的八个不同位点，在60-68°C的恒定温度下进行40-60分钟的扩增，从而产生多个目标序列拷贝。
讨论
LAMP技术已成功应用于麻疹病毒基因组的检测。Huang等人将重组酶聚合酶扩增（RPA）与LAMP结合在微流控平台上用于检测麻疹病毒。尽管这种RPA-LAMP微流控方法具有创新性，但仍存在一些局限性，如芯片制备复杂、多阶段扩增过程繁琐、设备依赖性强以及相对于简单等温方法适用性较低等问题。
结论
LAmCaD平台成功实现了使用自纯化的Cas12b蛋白、快速的5分钟RNA提取过程及简单设备，在90分钟内完成麻疹RNA的检测。该检测方法具有高特异性（92.59%），能够检测多种基因型，并具备双重检测功能。该平台所需的资本投入较低（每次反应成本约5-8美元），具有经济可行性。
作者贡献声明
Shivani Sharma：撰写初稿、数据可视化、验证、软件开发、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。
Shibendra Kumar Lal Karna：数据可视化、验证、方法设计、实验设计。
Sudhir Khanal：项目监督、资金筹集。
Yuba Raj Pokharel：撰写修订稿、数据可视化、验证、项目监督、软件开发、方法设计、实验设计、资金筹集、概念构思。
伦理声明
所有临床样本的收集和使用均符合机构伦理指南，并获得了相关人员的知情同意。该研究于2021年7月5日获得南亚大学机构生物安全委员会（SAU-IBSC）和机构伦理委员会（SAU-IEC）的批准（文件编号：SAU/FLSB IIECI 2021 -01）。同时，也获得了孟买国家病毒学研究所（NIV-Mumbai）和ICMR机构伦理委员会的批准（证书编号：……）。
相关附件
附件中包含详细的实验信息和补充数据，包括生物材料规格及方法流程。关键内容包括麻疹病毒的培养和纯化步骤（图S1–S2）、AapCas12b蛋白纯化方案、RT-LAMP引物设计及筛选结果（图S3–S8、表S1）。此外还提供了sgRNA序列（表S2和S3）、蛋白质表达和纯化数据（图S9等）。
利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。
资金支持
本研究得到了世界卫生组织（WHO）的资助（项目编号：202211213538-1/采购订单：202814880-1/单位参考：IVD/CDS/SEARO）。
利益冲突声明
Yuba Raj Pokharel表示获得了世界卫生组织的财务支持，并与南亚大学存在雇佣关系。其他作者声明不存在可能影响研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢南亚大学生命科学与生物技术学院提供的研究设施。同时，也非常感谢世界卫生组织东南亚区域办事处（WHO-SEARO）在协调工作、联系技术专家及试剂采购方面的帮助。此外，还要感谢Paul A Rota博士和Ahmed M. Kassem博士在整个研究过程中提供的专业技术指导。
