DIL-CRISPR：一种用于减轻昆虫基因编辑中G0期嵌合体致死性的实用方法

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：DIL-CRISPR: a practical approach to mitigate G 0 mosaic lethality in insect gene editing

基因组编辑中G0代嵌合致死问题通过稀释CRISPR/Cas9注射试剂（DIL-CRISPR）有效缓解，以烟粉虱Met1基因为例验证了稀释浓度与存活率、生殖系编辑效率的平衡关系。

　　

西泽秀梨|大门隆明

日本京都大学农学研究生院应用生物科学系，京都606-8502

摘要

在昆虫中进行基因组编辑通常是通过将基因组编辑试剂注入早期胚胎来实现的，这样产生的第0代（G₀）个体会成为基因镶嵌体。因此，针对那些其基因破坏会导致镶嵌体致死的基因进行编辑具有挑战性，因为大多数或所有的G₀个体往往无法存活到成年，从而阻碍了编辑等位基因在生殖细胞中的传递。在这里，我们提出了一种简单实用的方法——DIL-CRISPR，通过系统性地稀释CRISPR/Cas9注射混合物来减轻G₀的镶嵌体致死性。以烟草切根虫Spodoptera litura和幼虫激素受体基因Met1作为基准，我们证明了稀释注射混合物可以降低幼虫-蛹期镶嵌体表型的严重程度，并以剂量依赖的方式提高G₀的存活率。扩增子测序进一步显示，随着稀释程度的增加，体细胞突变频率下降，而生殖细胞突变率仍然足以建立突变系。值得注意的是，我们检测到体细胞和生殖细胞编辑效率之间存在显著差异，这可能反映了高度编辑的致死镶嵌体在达到成年之前就被选择性地淘汰了。因此，我们得出结论，DIL-CRISPR提供了一种可靠的方法来平衡G₀的存活率和生殖细胞编辑效果，将一种经验性的稀释实践转化为一种可推广的策略。总体而言，这种方法为生成具有镶嵌体致死基因的突变系提供了实用的解决方案，并且适用于多种昆虫物种，有助于在非模式昆虫中进行功能遗传学研究。

引言

基因组编辑技术的发展使得我们能够详细研究各种动物、植物和微生物的基因功能（Carroll, 2014; Knott and Doudna, 2018; Ran et al., 2013）。在昆虫中，基因组编辑通常是通过将CRISPR/Cas9等基因组编辑工具注入早期胚胎来进行的（Ahmed et al., 2025; Bassett and Liu, 2014; Bassett et al., 2013; Daimon et al., 2014）。由于昆虫胚胎在注射时处于合胞胚阶段，并且会发生表面切割，因此产生的G₀（第0代）个体会成为携带野生型（wt）和多个突变等位基因混合物的基因镶嵌体（Ahmed et al., 2025; Daimon, 2015; Daimon et al., 2014）。

一般来说，体细胞镶嵌型的G₀个体提供了一个评估目标基因非细胞自主功能的有用机会，而无需建立稳定的突变系（Ahmed et al., 2025; Daimon, 2015; Daimon et al., 2014; Zhang and Reed, 2017）。这种G₀镶嵌体方法允许在单一代内评估表型（Mazo-Vargas et al., 2022; Yoda et al., 2014; Zhang and Reed, 2016）。然而，对于许多项目来说，建立可遗传的基因组编辑系仍然是必要的，因为基因固定的突变等位基因能够支持详细且可重复的表型分析。

先前的研究表明，当破坏那些其缺失会导致G₀镶嵌体致死的基因时，会遇到一个主要障碍（Daimon, 2015; Daimon et al., 2014; Sollazzo et al., 2024; Wu et al., 2018）。对于这类基因，G₀个体的体细胞镶嵌现象会阻止其发育成可育的成虫，因为大多数或所有的G₀个体都会因镶嵌体致死表型而死亡。在产生高编辑效率的实验条件下，这一难题尤为突出。尽管在研究非模式昆虫的研究人员中这一点被广泛认可（Daimon, 2015; Sollazzo et al., 2024; Wu et al., 2018; Zhang and Reed, 2017），但这个“G₀致死问题”仅被间接提及，尚未建立通用解决方案。

在G₀体细胞镶嵌体分析中，人们采用了一种经验性方法来处理与目标基因破坏相关的致死现象。例如，Zhang和Reed（2017）描述了降低注射的Cas9核糖核蛋白（RNPs）浓度可以减少蝴蝶的镶嵌体致死性。此外，在家蚕Bombyx mori中，我们之前在尝试建立抗变态转录因子基因Krüppel homolog 1（Kr-h1）的生殖细胞突变系时遇到了困难，因为所有的G₀幼虫都死于幼虫-蛹期镶嵌体，没有存活的成虫出现（Daimon et al., 2014）。后来，我们通过将转录激活因子样内切酶mRNAs的注射混合物稀释至1/100来建立了可遗传的突变系（T.D.，未发表的结果）。尽管有这些观察结果，但这种稀释策略尚未经过系统测试。因此，目前尚不清楚它是否能够可靠地支持从存活的G₀成虫中恢复可遗传的突变。在没有定量分析稀释如何影响体细胞和生殖细胞编辑结果的情况下，这种稀释方法仍然只是一种缺乏明确技术或理论基础的实践。

在本研究中，我们旨在提供技术和概念基础，以克服昆虫基因组编辑中的G₀镶嵌体致死性。我们研究了稀释Cas9 RNP注射混合物是否可以减轻G₀的致死性，并使下一代能够恢复生殖细胞突变。为此，我们使用了烟草切根虫Spodoptera litura作为模型物种，并针对镶嵌体致死基因Met1（Methoprene-tolerant 1）进行实验，该基因编码一种幼虫激素（JH）受体（Daimon et al., 2015; Konopova and Jindra, 2007）。通过系统地稀释Cas9 RNP注射混合物，我们评估了稀释对G₀存活率、体细胞镶嵌表型和生殖细胞突变率的影响。此外，我们还定量评估了G₀体细胞和生殖细胞中的编辑效率，以确定稀释如何调节编辑结果。

我们的结果清楚地表明，稀释可以减轻G₀的镶嵌体致死性。稀释增加了能够存活到成年并成功将编辑等位基因传递给后代的G₀个体的比例。随着稀释程度的增加，体细胞和生殖细胞的编辑效率都下降了，这表明稀释可以在减少致死性体细胞编辑的同时保持足够的生殖细胞编辑，从而确保可遗传的传递。综上所述，我们发现DIL-CRISPR（一种通过稀释CRISPR/Cas9注射混合物创建的方法）提供了一种简单、实用且可推广的方法来解决G₀致死性问题。

章节片段

昆虫

我们维持了一种野生型（wt）的Spodoptera litura实验室品系[Ishihara品系（Cheng et al., 2017）（鳞翅目：夜蛾科）（Maruoka et al., 2024; Shirai et al., 2021）。简要来说，幼虫在人工饲料（Kuwanohana或Insecta-LFS）上饲养，温度为25 ± 1 °C，光照周期为12L:12D。蛹被鉴定性别，成虫则提供10%的蜂蜜溶液。

Cas9和sgRNA的制备

我们从Integrated DNA Technologies (IDT)购买了Cas9蛋白（Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3，目录号#1081058）。

在Met1基因受损的幼虫中G₀镶嵌体致死性

我们选择S. litura作为模型物种，因为它具有六个幼虫龄期（图1A），并且有高质量的全基因组序列（Cheng et al., 2017）和成熟的胚胎显微注射方法（Maruoka et al., 2024; Shirai et al., 2021）。我们选择Met1基因是因为其基因破坏预计会导致幼虫致死，这一点在之前的家蚕Bombyx mori研究中也有报道（Daimon et al.,

讨论

我们的研究结果表明，稀释Cas9 RNP注射混合物（我们称之为DIL-CRISPR）提供了一种简单实用的方法来减轻G₀的镶嵌体致死性。此外，通过调整注射混合物的浓度，可以平衡G₀的镶嵌体致死性和生殖细胞突变率，从而为建立生殖细胞突变系提供合理的策略。

为了验证这种方法，我们使用Met1作为基准基因。鳞翅目昆虫拥有两个同源的Met

CRediT作者贡献声明

大门隆明：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，可视化，监督，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。西泽秀梨：撰写——原始草稿，方法学，研究，数据管理

数据可用性

扩增子测序数据集已存放在FigShare上，DOI为https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30773864。原始数据包含在手稿中。如需更多支持数据，可向相应作者索取。

利益冲突声明

我们声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Shirai Yu在卵显微注射方面的指导，感谢Zefu Wan在显微注射实验中的协助，以及Daimon实验室成员们的宝贵讨论。这项工作得到了JSPS KAKENHI（编号24H00511, 24K21869, 22K19179, 20H02999）的支持，部分还得到了日本内阁府跨部门Moonshot农业、林业和渔业研究与发展计划（编号JPJ009237）的支持（T.D.）。