基于RNA纳米环辅助的自催化Cas13a生物传感器用于超灵敏RNA检测

《npj Biosensing》：Autocatalytic Cas13a biosensor enabled by RNA-nanocircles for ultrasensitive RNA detection

　　

基于RNA纳米环辅助的自催化Cas13a生物传感器用于超灵敏RNA检测。Cas13a（CRISPR-associated protein 13a）诊断系统已广泛用于RNA靶标的检测。然而，在不进行预扩增的情况下，此类系统难以实现超灵敏（RT-PCR水平）的单管RNA检测。在此，研究人员发现双链RNA（dsRNA）可有效激活Cas13a核糖核蛋白（RNP）的trans-cleavage（反式切割）活性，而活化的Cas13a RNP对dsRNA的切割速率极低。此外，经特殊设计的RNA纳米环（RNA-Nanocircle）激活Cas13a RNP的能力有限，但一旦环状结构被切割变为线性，其激活能力即得以恢复。基于这种控制Cas13a RNPtrans-cleavage活性的原创方法，研究人员开发了一种由RNA纳米环辅助的Cas13a自催化生物传感系统，该系统允许一个靶标RNA激活大量Cas13a RNP。利用该方法，研究人员展示了在15分钟内无需预扩增即可检测1aM的合成RNA靶标。该生物传感器的临床效用通过在结直肠癌（CRC）患者血浆样本中监测microRNA-21（miRNA-21）水平得到了验证。这种创新方法凸显了基于Cas13a的生物传感器在精准肿瘤学中的潜力，为液体活检中的RNA生物标志物检测提供了一种快速、无创且超灵敏的方法。

论文解读：基于RNA纳米环辅助的自催化Cas13a生物传感器

本研究论文题为“Autocatalytic Cas13a biosensor enabled by RNA-nanocircles for ultrasensitive RNA detection”，发表于《npj Biosensing》期刊。该研究聚焦于解决当前CRISPR-Cas13a诊断系统在RNA检测中面临的灵敏度瓶颈问题。

在背景方面，Cas13a作为一种可编程的RNA引导核糖核酸酶，已被广泛应用于RNA检测。其基本机制在于当Cas13a结合靶标RNA后，会表现出序列特异性的RNA靶标切割（cis-cleavage，顺式切割）和非特异性切割单链RNA（ssRNA）的侧支切割（trans-cleavage，反式切割）特性。然而，传统的Cas13a生物传感系统直接识别RNA靶标并切割ssRNA荧光淬灭报告基因时，灵敏度通常局限于皮摩尔（pM）级别。为了实现阿摩尔（aM）级别的超灵敏检测，现有技术往往依赖核酸预扩增技术，如重组酶聚合酶扩增（RPA）或环介导等温扩增（LAMP）。但这些方法不仅需要专业实验室设备和试剂，还存在假阳性和扩增子污染的风险，阻碍了便捷、低成本临床检测的发展。尽管已有研究尝试通过信号放大技术或串联Cas系统（如Cas13-Csm6、Cas13-Cas12a）来规避预扩增，但这些方法要么需要特殊仪器，要么反应时间过长（2-3小时），无法满足即时检测（POCT）对15-20分钟内完成aM级灵敏度的要求。因此，开发一种无需预扩增、单管反应且具有自催化特性的超灵敏RNA检测方法成为迫切需求。

为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先是基于点击化学法合成环状单链RNA（Cir-ssRNA）及其形成的RNA纳米环结构；其次是利用荧光共振能量转移（FRET）技术研究Cas13a的激活机制；第三是通过凝胶电泳和荧光报告基因检测评估Cas13a对不同核酸底物的trans-cleavage能力；第四是构建并优化基于RNA纳米环的自催化生物传感系统；最后是利用该系统对来自新南威尔士大学健康区生物样本库（Health Precincts Biobank of UNSW）的结直肠癌（CRC）患者血浆临床样本进行microRNA-21（miRNA-21）的检测验证。

研究结果部分详细阐述了以下发现：

双链RNA能够触发Cas13a RNP的激活

研究人员探索了除传统单链RNA（ssRNA）以外的多种核酸类型对Cas13a的激活能力。研究发现，硫代磷酸酯修饰的ssRNA（ps-ssRNA）和RNA-DNA杂交链仅能产生有限的激活，而双链RNA（dsRNA）意外地被发现是Cas13a的高效激活剂，其激活效率可达53%。进一步的FRET实验证实，dsRNA中的靶标RNA（t-RNA）能够与Cas13a的向导RNA（gRNA）结合，导致互补RNA（cRNA）释放，从而激活Cas13a RNP。

活化的Cas13a RNP无法对dsRNA进行trans-切割

虽然dsRNA能有效激活Cas13a，但随后的研究发现，活化后的Cas13a RNP却不具备切割dsRNA底物的能力。凝胶电泳和荧光报告基因检测均表明，活化的Cas13a仅能非特异性切割ssRNA，而对dsRNA无明显的切割活性。这一“可激活但难切割”的特性是构建后续自催化系统的关键基础。

RNA纳米环的合成与表征

研究人员构建了包含dsRNA区域和短ssRNA连接区的RNA纳米环结构。凝胶电泳证实了环状ssRNA（Cir-ssRNA）的成功合成，且其迁移率慢于线性ssRNA。研究发现，环状结构限制了其对Cas13a的激活能力，且连接区（linker）越短，背景信号越低。当构建带有荧光报告基团（FAM）和淬灭基团（BHQ1）的荧光RNA纳米环后，研究发现连接区长度为L-5时性能最佳，且该结构在rCutSmart缓冲液和人体血浆中15分钟内表现出良好的稳定性。

基于Cas13a的自催化生物传感器基本特性评估

基于上述发现，研究人员设计了Cas13a自催化生物传感器（Cas13a-autosensor-1）。其工作原理是：靶标RNA激活Cas13a RNP，后者切割RNA纳米环的ssRNA区域，释放出线性的dsRNA片段，这些片段作为替代靶标进一步激活新的Cas13a RNP，形成自催化循环。实验结果显示，与标准Cas13a生物传感器信号的线性增长不同，该自催化系统呈现指数级信号增长，并在15分钟内实现了1aM的合成RNA靶标检测限。

基于Cas13a的自催化生物传感器在CRC液体活检样本中的应用

为提高系统的通用性，研究人员设计了双Cas13a RNP系统（Cas13a-autosensor-2）。在该系统中，Cas13a RNP-1负责识别特定靶标，而Cas13a RNP-2与匹配的RNA纳米环负责驱动自催化反应。这使得仅需改变RNP-1的gRNA即可检测不同靶标。研究人员将该系统应用于结直肠癌（CRC）血浆样本中miRNA-21的检测。结果显示，该系统对干扰序列具有极高的特异性。临床样本分析表明，随着肿瘤分期从T1进展到T4，miRNA-21浓度从飞摩尔（fM）上升至皮摩尔（pM）并趋于稳定，且化疗后患者样本中的miRNA-21浓度显著下降，结果与RT-qPCR检测结果趋势一致。

在讨论部分，研究人员指出，本研究首次发现了dsRNA能有效激活Cas13a RNP但难以被其切割，以及环状RNA经线性化后可恢复激活能力的原创特性。基于此建立的RNA纳米环辅助Cas13a自催化生物传感系统，改变了传统“一靶标激活一RNP”的模式，实现了单个靶标激活大量RNP的“雪崩效应”，从而在无需预扩增的情况下达到了RT-PCR级别的灵敏度。双RNP系统的设计进一步提升了该平台的通用性，使其可作为现有Cas13a生物传感系统的通用信号放大器。尽管该技术在合成RNA纳米环的步骤简化及在未经处理的血浆中的稳定性方面仍存在改进空间，但该自催化CRISPR平台为临床实践中癌症进展监测和治疗评估提供了强有力的工具。