《The Crop Journal》：CRISPR/Cas9 knockout of
BnaA01.AP2 increases seed oil content with no yield penalty in
Brassica napus L
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本研究针对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)种子油产量提升的育种难题，通过CRISPR/Cas9技术特异性敲除BnaA01.AP2基因，发现该操作可显著提高种子产量和含油量，从而提升总油产量，且未发现其他农艺性状负面影响。研究进一步阐明BnaA01.AP2通过直接抑制BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L等关键基因表达，间接调控糖酵解、脂肪酸生物合成和三酰甘油组装通路，进而抑制油脂积累的分子机制。该研究为油菜高油育种提供了重要基因资源和理论依据。
油菜是世界上第三大油料作物，其种子油产量由种子产量和含油量共同决定。然而，这两个关键农艺性状往往存在负相关关系，同步改良难度极大。以往研究表明，同时抑制甘蓝型油菜中四个BnAP2旁系同源基因会导致花器官发育异常和种子减产，这严重限制了其在育种中的应用。因此，解析特定BnAP2旁系同源基因的功能，寻找在不影响产量的前提下提高含油量的靶点，成为油菜遗传改良的重要课题。
在这项发表于《The Crop Journal》的研究中，研究人员独辟蹊径，发现四个BnAP2旁系同源基因中，BnaA01.AP2在花组织中表达量最低，暗示其可能对花发育影响较小。基于此，他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在甘蓝型油菜K407自交系中成功创制了BnaA01.AP2的纯合突变体。
研究人员采用了多种关键技术方法：利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体并转化甘蓝型油菜；通过气相色谱分析种子脂肪酸组成和含量；利用RNA-seq技术分析发育种子（28天）的转录组差异；运用染色质免疫共沉淀(ChIP)、酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶报告基因(Dual-LUC)等实验验证转录因子与下游靶基因的直接调控关系。
研究结果如下：
3.1. BnAP2旁系同源基因的序列特征
研究人员从甘蓝型油菜K407自交系中克隆了四个BnAP2旁系同源基因。系统进化分析显示，BnaA01.AP2与其他三个旁系同源基因亲缘关系相对较远，暗示其可能发生了功能分化。
3.2. BnAP2旁系同源基因的表达模式分析
表达模式分析显示，四个BnAP2基因在萌发种子、根、茎和扩展叶片中表达模式相似，在花中高表达，但BnaA01.AP2在花中表达量极低。所有基因在发育种子中均高表达，尤其在油脂活跃积累期（20-30天），提示它们可能参与调控种子油脂积累。亚细胞定位表明四个BnAP2蛋白均定位于细胞核，酵母转录自激活实验证实它们均具有转录激活活性。
3.3. CRISPR/Cas9产生的BnaA01.AP2无效突变体表现出增强的种子油产量
成功获得两个BnaA01.AP2纯合突变体（L1和L2）。与野生型相比，突变体花器官形态正常，但植株增高、角果增宽、单粒种子重量显著增加，从而导致种子产量提升。更重要的是，突变体种子总脂肪酸含量显著提高，其中棕榈酸(C16:0)比例增加。最终，种子油产量显著提高，且未检测到其他农艺性状的负面影响。在L1突变体背景中过表达BnaA01.AP2可完全回复突变体的表型至野生型水平，证实表型变化确实由BnaA01.AP2突变引起。
3.4. ‘K407’和L1植株发育28天种子中的差异表达基因
对28天发育种子进行RNA-seq分析，共发现8196个差异表达基因(DEG)，其中4307个上调，3889个下调。KEGG富集分析表明这些DEGs富集于脂肪酸生物合成和代谢等通路。32个与油脂合成相关的DEGs被重点关注，包括多个已知正调控（如BnaA09.WRI1, BnaA09.L1L）或负调控（如BnaC04.WRKY6, BnaA09.TT8）油脂积累的转录因子及其下游结构基因。RT-qPCR验证了这些基因的表达变化，并且其在互补植株中表达恢复至野生型水平。
3.5. BnaA01.AP2在甘蓝型油菜发育种子中直接靶向BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L
通过酵母单杂交(Y1H)和电泳迁移率变动分析(EMSA)证实BnaA01.AP2能特异性结合AT-rich motif (TTTGTT/AACAAA)。利用ChIP-qPCR、Y1H和Dual-LUC实验，研究人员证明BnaA01.AP2蛋白在体内外能直接结合BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L的启动子区域，并抑制这些基因的转录活性。
综上所述，本研究得出结论：BnaA01.AP2是甘蓝型油菜种子油脂积累的关键负调控因子。CRISPR/Cas9介导的BnaA01.AP2特异性敲除，能够通过直接抑制下游关键油脂合成基因（如WRI1, L1L, BCCP1），并间接影响更广泛的油脂合成通路，从而在不引起花器官缺陷和产量损失的前提下，协同提高种子产量和含油量，最终显著提升种子油产量。
这项研究的创新性和重要意义在于：首次明确了BnaA01.AP2这一特定旁系同源基因在调控油菜种子油脂积累中的独立功能，避免了同时敲除多个旁系同源基因带来的负面效应；系统解析了BnaA01.AP2通过直接和间接方式调控油脂合成网络的分子机制；创制的BnaA01.AP2突变体是宝贵的育种材料，为通过生物技术手段培育高油油菜新品种提供了高效的基因靶点和优异的种质资源，对保障植物油供给安全具有重要应用前景。
