《Materials Today Bio》：NIR-II Biomimetic Nanoplatform Optogenetic CD274 Editing of HNSCC Immunogenicity for Enhanced Photoimmunotherapy
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本研究针对头颈鳞状细胞癌（HNSCC）免疫原性低、T细胞浸润不足的难题，开发了一种α-LDLR修饰的红细胞膜仿生纳米平台（ARPC），该平台可递送NIR-II光热聚合物和CRISPR/Cas9质粒，通过NIR-II激光照射诱导热应激上调Hsp70，进而启动CRISPR/Cas9对CD274基因进行编辑，同时温和光热疗法诱导免疫原性细胞死亡（ICD），增强CD8+T细胞浸润，实现了高效的光免疫联合治疗，为克服HNSCC低免疫源性提供了新策略。
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见癌症，约占头颈部肿瘤的90%。尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法在HNSCC治疗中取得了显著突破，但肿瘤固有的低免疫原性微环境和有限的T细胞浸润严重限制了其疗效。特别是HNSCC常表现为"冷肿瘤"特征，缺乏足够的T细胞浸润和免疫抑制性微环境，导致对ICB疗法的反应不佳。此外，目前针对CD274（PD-L1）的单克隆抗体虽然已成为多种癌症的标准治疗，但由于CD274在正常组织中广泛分布，其广泛阻断可能导致严重的免疫相关炎症反应，如免疫性肺炎、心肌炎和甲状腺功能减退等，严重影响ICB治疗的临床效果。
针对这些挑战，浙江人民医院康复医学中心的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究，开发了一种近红外二区（NIR-II）光遗传学CRISPR/Cas9纳米平台，通过编辑CD274基因来增强HNSCC的免疫原性，实现高效的光免疫治疗。该研究巧妙地结合了仿生纳米技术、光遗传学控制和基因编辑技术，为克服HNSCC的低免疫原性提供了一种新颖的治疗策略。
研究人员采用了几项关键技术方法：首先构建了α-LDLR（低密度脂蛋白受体抗体）修饰的红细胞膜仿生纳米载体，用于包裹NIR-II光热聚合物和Hsp70启动子驱动的CRISPR/Cas9质粒；利用NIR-II激光（1060 nm）照射触发温和光热疗法（MPTT），诱导热休克蛋白70（Hsp70）表达，进而启动CRISPR/Cas9系统对CD274基因进行编辑；通过体外细胞实验和体内小鼠模型（包括皮下移植瘤和原位喉癌模型）评估纳米平台的靶向性、基因编辑效率和抗肿瘤效果；采用全基因组测序分析评估基因编辑的特异性和安全性。
制备和表征ARPC
研究人员首先通过Western blot分析了26种癌症类型中CD274的表达情况，确认其在HNSCC中的高表达。随后设计了针对CD274的sgRNA，构建了Hsp70启动子驱动的CRISPR/Cas9系统。制备的ARPC纳米颗粒具有核壳结构，平均粒径为313 nm，zeta电位为-12.9 mV。透射电镜显示纳米颗粒呈球形，能谱 mapping证实了质粒DNA和光热材料的成功包裹。ARPC在NIR-II激光照射下表现出良好的光热转换性能（光热转换效率为39.32%）和光稳定性，同时红细胞膜修饰赋予了其良好的免疫逃逸能力。
细胞摄取和细胞毒性分析
流式细胞术和共聚焦显微镜显示，由于α-LDLR受体的存在，ARPC在SCC7细胞中的内化效率最高。细胞毒性实验表明，在没有激光照射时，ARPC的细胞毒性较低，但在激光照射下能显著诱导细胞凋亡，表现出浓度依赖性的细胞杀伤效果。
Hsp70启动子驱动的CD274基因组编辑
研究证实，在NIR-II激光照射下，ARPC能有效激活Hsp70启动子，使GFP表达水平达到58.6%，显著高于PC（3.6%）和RPC（36%）。Western blot和免疫荧光显示，随着加热时间的增加，Hsp70表达上调，CD274表达下调，Cas9蛋白表达增加。流式细胞术分析显示，ARPC（+激光）组中CD274阴性细胞比例达到45.3%，表明CRISPR/Cas9系统成功编辑了CD274基因。
全基因组测序分析
通过对编辑样本和对照样本进行全基因组测序，研究人员评估了ARPC介导的基因编辑的特异性。结果显示，对照组和ARPC组之间的单核苷酸多态性（SNP）差异较小，主要区别在于插入缺失（InDel）。通过Cas-OFFinder软件预测全基因组范围内的脱靶位点，发现在sgRNA同源区域内的潜在脱靶位点有限，证明了该系统的编辑特异性。
诱导免疫原性细胞死亡的能力
研究发现ARPC能有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD），表现为钙网蛋白（CRT）易位至细胞膜表面，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和ATP的释放，以及I型干扰素的产生。这些损伤相关分子模式（DAMPs）能促进树突状细胞（DC）成熟和T细胞活化。
体外诱导ICD相关免疫细胞
通过将处理后的SCC7细胞与RAW264.7细胞、原代T细胞和树突状细胞共培养，研究发现ARPC（+激光）处理能显著增加M1型巨噬细胞（CD80+CD86+）比例（5.0%）、CD8+T细胞比例（18.1%）和成熟DC比例（44.3%），表明ARPC能有效激活抗肿瘤免疫应答。
体内分布和抗肿瘤疗效
体内实验显示，ARPC能有效靶向肿瘤组织，在注射后4小时即可在肿瘤部位检测到明显荧光信号。在0.75 W/cm2的激光照射下，肿瘤部位温度可达到42°C，实现温和光热治疗。ARPC（+激光）治疗能显著抑制肿瘤生长，提高小鼠生存率。
皮下肿瘤治疗和CD274下调效果
在皮下移植瘤模型中，ARPC（+激光）治疗组肿瘤体积最小，Western blot和免疫组化证实该组Hsp70表达上调，CD274表达下调。流式细胞术显示ARPC（+激光）组CD274阴性细胞比例最高，TUNEL染色显示细胞凋亡增加。
肿瘤部位的免疫原性细胞死亡效应
对肿瘤组织的分析显示，ARPC（+激光）治疗能显著提高炎症细胞因子（IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-6）水平，诱导CRT表达上调和HMGB1核外释放。流式细胞术分析显示，ARPC（+激光）组中成熟DC比例（16.3%）、CD8+T细胞浸润比例（32.0%）和巨噬细胞比例（36.8%）均显著高于其他组。
淋巴结和脾脏中的炎症细胞
类似地，在淋巴结和脾脏中，ARPC（+激光）治疗也能显著增加成熟DC、CD8+T细胞和巨噬细胞的比例，表明治疗诱导的系统性免疫应答。
SCC7原位癌模型和ARPC的靶向特异性
在原位喉癌模型中，ARPC同样表现出良好的肿瘤靶向能力，能在6小时内积累于肿瘤部位。虽然由于组织深度，达到理想治疗温度需要较长时间（9分钟），但ARPC（+激光）治疗仍能有效抑制肿瘤生长，改善小鼠生存状态。
治疗效力和生物相容性
在原位癌模型中，ARPC（+激光）治疗能显著抑制肿瘤生长，维持小鼠体重，组织切片显示CD274表达下调，ICD相关标志物变化，免疫细胞浸润增加。重要器官的H&E染色和血液生化指标分析表明ARPC具有良好的生物相容性。
这项研究成功开发了一种NIR-II光遗传学CRISPR/Cas9纳米平台，通过α-LDLR介导的主动靶向和红细胞膜赋予的免疫逃逸能力，实现了对肿瘤组织的特异性递送。NIR-II激光激活的Hsp70启动子引导的CRISPR/Cas9系统能永久性破坏CD274基因，同时温和光热疗法诱导的ICD能触发多方面的抗肿瘤免疫应答，包括促进DC成熟、增加M1/M2巨噬细胞比例、增强CD8+T细胞浸润和增殖，以及减少免疫抑制细胞比例，从而重塑肿瘤免疫微环境。
虽然全基因组测序结果提供了ARPC介导的CD274基因编辑在短期内的生物安全性证据，但这种治疗方法的长期效果和持久性仍需进一步验证。未来研究需要对治愈小鼠进行长期随访，评估CD274破坏的持续性，检测主要器官中潜在的脱靶修饰。此外，持续的免疫学监测对于识别可能的自身免疫表现以及确定CD274蛋白是否在复发肿瘤组织中再次表达也至关重要。
在临床转化方面，虽然本研究证明了NIR-II在皮下和原位HNSCC模型中精确光遗传学激活的有效性，但将这种方法扩展到深部头颈部恶性肿瘤（如下咽癌）仍面临挑战。NIR-II照射在致密组织中的有限穿透深度可能限制其在深部肿瘤区域的应用。未来的工作可能会探索临床可行的递送策略，包括内窥镜或光纤激光照射的辅助，以及结合导光探针或光热敏化剂以增强靶点的能量沉积。这些改进将有助于NIR-II光遗传学基因编辑技术适应复杂的解剖位置，加强其在临床肿瘤学应用中的转化潜力。
总体而言，这项研究为HNSCC的有效ICB治疗提供了一种创新的替代策略，为未来的肿瘤基因编辑疗法带来了希望。
