使用无需PAM的CRISPR-Cas12a系统结合引物延伸扩增技术对piRNAs进行灵敏检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Sensitive Detection of piRNAs Using PAM-Free CRISPR-Cas12a System Integrated with Primer Extension Amplification

CRISPR-Cas12a诊断平台通过开发PAM-free的PF-PEA策略实现无PAM依赖的高灵敏度检测，结合TMSD和PEA信号放大技术成功应用于乳腺癌标志物piRNA-36026检测，灵敏度达0.86 pM，线性R2=0.9964。

　　

陈翔|余妍|梁志刚|秦露露|徐冠宏|魏芳迪|杨静|胡琴|岑瑶

南京医科大学药学院，中国江苏省南京市211166

摘要

基于CRISPR-Cas12a的诊断平台从根本上改变了核酸检测的范式。然而，其广泛应用仍受到原间隔序列（PAM）的限制。为了解决这一限制，我们开发了一种无PAM引物延伸扩增（PF-PEA）策略，该策略有效规避了对PAM的依赖性，同时保持了强大的检测效果。该方法采用一种引物序列，该序列能够在非目标链上进行聚合酶介导的延伸，从而连续再生无PAM的双链DNA激活剂，其激活效率可与依赖PAM的系统相媲美。通过将PF-PEA与趾爪介导的链位移和引物延伸扩增结合，建立了一个级联信号放大平台，用于检测乳腺癌生物标志物piRNA-36026，该平台具有高灵敏度（LOD = 0.86 pM）和高线性（R2 = 0.9964）。这种创新方法不仅规避了PAM序列的限制，还显示出作为多种核酸分析物的通用检测平台的广泛潜力，包括DNA和RNA目标。

引言

PIWI相互作用RNA（piRNAs）是一类长度在24-31个核苷酸之间的小非编码RNA[1]。这些piRNAs最初被发现在生殖细胞中高度表达，并具有抑制转座元件的能力，从而保持基因组的完整性[2]。这种沉默机制在保护基因组免受配子发生和生育过程中由转座子引起的损伤方面起着重要作用[3]。此外，已有研究表明，piRNAs在体细胞中广泛表达，并通过调节转录基因沉默、翻译调控、mRNA稳定性、维持干细胞功能以及与多种蛋白质相互作用等过程发挥调控作用[4],[5]。特别是，piRNAs特异性地与Argonaute蛋白亚家族的PIWI蛋白结合，形成piRNA相关沉默复合体（piRISC），以执行生物学功能[6]。PIWI-piRNA通路在转座元件的沉默、端粒保护复合体的组装、胚胎发育的调控以及生殖细胞内基因组的稳定性和完整性的维持中具有重要意义[7],[8],[9]。新兴证据表明，piRNAs与多种恶性肿瘤有关，包括胃癌[10],[11]、肾癌[12]、前列腺癌[13]、乳腺癌[14],[15]和结直肠癌[16]，以及多种疾病，如生殖系统[17]、心血管[18],[19]和神经系统[20]疾病。值得注意的是，piRNAs在人体体液中可被检测到，在血清中尤其丰富[21]，且形式非常稳定[22]。因此，piRNAs是开发非侵入性诊断检测方法的优秀生物标志物。

piRNAs的检测传统上使用微阵列分析[23]、下一代测序[24]和Northern印迹[25]等方法进行。然而，这些方法存在一些技术限制，如需要大量样本、特异性较低和灵敏度中等。相比之下，聚合酶链反应（PCR）[26]提供了更高的piRNA定量灵敏度，但它需要复杂的逆转录步骤来从piRNA模板生成互补DNA。为了解决这些挑战，基于荧光的新生物传感平台已被开发出来。这些先进的传感器通常结合了核酸扩增技术，包括：杂交链反应（HCR）[27]、催化发夹组装（CHA）[28]、滚环扩增（RCA）[29]。结合荧光技术和核酸扩增技术的生物传感器已有效实现了对piRNAs的灵敏检测。

CRISPR-Cas（规律间隔短回文重复序列，CRISPR相关蛋白）系统作为一种变革性技术，在基因编辑和分子诊断中发挥了重要作用，这归功于其无与伦比的精确识别和特异性[30]。特别是CRISPR-Cas12a变体因其独特的核酸酶特性而受到了大量研究关注。典型的CRISPR-Cas12a系统包括三个关键组成部分：CRISPR RNA（crRNA）、Cas12a效应蛋白和激活分子[31]。当crRNA识别到激活分子后，Cas12a复合体会发生构象激活，表现出对结合的激活分子的顺式切割以及对非特异性单链DNA（ssDNA）分子的无差别切割活性[32],[33]。这种独特的两功能切割能力使Cas12a在分析应用中具有显著优势。目前的激活剂设计主要分为两种形式：单链激活剂（ss-activators）[34]和双链激活剂（ds-activators）[31]。然而，每种形式都有明显的局限性：ss-activators的靶标特异性较差，而ds-activators通常需要PAM序列的存在，从而限制了其广泛应用[35]。有趣的是，也有报道称PAM序列对ds-activator的解旋贡献很小，在随后的切割过程中作用不大[32]。为了规避与PAM相关的限制，已经开发了几种创新策略：(1) 在ds-activators中引入气泡结构[36]或切口PAM序列[37]以降低双链的结合亲和力，从而便于其解旋和crRNA与目标链（TS）的结合；(2) 通过高温或碱性溶液解旋ds-activators[38]，或用Lambda外切酶消化非目标链（NTS），然后以ss-activator的形式激活Cas12a；(3) 设计独立于PAM的发夹结构ds-activators[40]，以激活Cas12a；(4) 实施带有趾爪介导的链位移（TMSD）[35],[41]能力的粘性末端ds-activators，以识别crRNA并激活Cas12a；(5) 使用二硫苏糖醇（DTT）来缓解PAM序列的限制[42]。

很少有研究人员尝试直接使用未经修饰的无PAM ds-activators来激活Cas12a。因此，我们系统地研究了无PAM ds-activators用于Cas12a激活的可行性。实验结果表明，无PAM ds-activators也可以激活Cas12a。比较分析显示，在较低的激活剂浓度下，无PAM ds-activators的激活效率明显低于含PAM的激活剂，而在较高激活剂浓度下这种差异减小。为了弥补激活效率的差异，我们开发了一种新的扩增策略，其中通过Klenow Fragment（KF）聚合酶介导的延伸，在NTS上连续再生无PAM ds-activators。这种方法使无PAM ds-activators能够达到与含PAM变体相当的激活效率。为了进一步提高无PAM CRISPR-Cas12a系统的检测灵敏度，通过将TMSD与引物延伸扩增结合，建立了一种级联信号放大方法。目前，CRISPR-Cas12a系统在piRNAs检测中的应用仍然很少探索，尽管它们已被广泛用于检测microRNAs（miRNAs）等生物标志物。在这里，我们利用基于CRISPR-Cas12a的级联信号放大技术超灵敏地检测了乳腺癌生物标志物piRNA-36026，显示出显著的检测能力提升，同时完全不受PAM序列要求的限制。

材料与试剂

所有寡核苷酸（如支持信息表S1-S2所示）由上海 Sangon Biotechnology Co.; Ltd.（中国上海）合成和纯化。LbaCas12a核酸酶（Cpf1）购自Novoprotein Scientific Inc.（中国上海）。Klenow Fragment（3'→5' exo-）购自Vazyme Biotech Co.; Ltd.（中国南京）。dNTP购自上海 Sangon Biotechnology Co., Ltd（中国上海）。所有实验用水均通过

无PAM dsDNA激活剂介导的Cas12a激活

为了规避PAM要求的限制，系统评估了无PAM ds-activators对Cas12a核酸酶活性的激活效率。通过测量Cas12a对FQ报告探针的转切割活性产生的荧光信号来定量评估激活效率。图1A展示了三种不同的激活模式：ss-activators、含PAM序列的ds-activators和不含PAM序列的ds-activators。

结论

总之，我们发现未经修饰的无PAM ds-activators仍能诱导Cas12a核酸酶的激活，尽管效率低于传统的ss-activators和含PAM的ds-activators。为了弥补无PAM ds-activators的激活效率不足，我们开发了PF-PEA策略。该方法将引物序列纳入Cas12a激活系统中，从而实现无PAM ds-activators的连续生成

CRediT作者贡献声明

余妍：资源、方法学、正式分析。陈翔：撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、数据管理。秦露露：验证、资源、正式分析。梁志刚：资源、正式分析、概念化。徐冠宏：验证、监督、资源。杨静：验证、监督、资源。魏芳迪：验证、监督、资源。岑瑶：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。胡琴：撰写——审阅与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号81973283、61775099、21705080）、江苏省自然科学基金（编号BK20221304、BK20171487、BK20171043）、江苏省高等学校“蓝色计划”基金、药用资源化学与分子工程国家重点实验室（广西师范大学）（CMEMR2024-B09）以及化学与生物传感国家重点实验室（湖南）的开放资金的支持

陈翔目前是南京医科大学攻读硕士学位的研究生，专注于CRISPR/Cas系统的应用。她于2023年在南京医科大学获得了学士学位。