热敏水凝胶增强的RPA-CRISPR/Cas12a生物传感器，用于超灵敏检测乳腺癌ctDNA中的甲基化位点

《Analytica Chimica Acta》：Thermosensitive Hydrogel-Enhanced RPA-CRISPR/Cas12a Biosensor for Ultrasensitive Detection of Methylated Loci in Breast Cancer ctDNA

本研究开发了一种基于热敏水凝胶的一管RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，结合甲基化敏感限制酶（MSRE），可特异性识别低丰度甲基化ctDNA，灵敏度达1×10^-8 ng/μL，较现有方法提升2倍，特异性达100%。

　　

Jianxun Hou|Yingjie Wang|Weiguang Yuan|Yajie Gong|Yuanyuan Yu|Xuquan Qin|Hui Li|Youxue Zhang|Huawen Shi|Yanbo Chen|Xianyu Zhang

哈尔滨医科大学附属医院，中国黑龙江省哈尔滨市150086

摘要

背景

乳腺癌组织与正常组织之间存在甲基化差异。肿瘤细胞释放的甲基化循环肿瘤DNA（ctDNA）为使用甲基化ctDNA进行乳腺癌液体活检提供了基础。然而，至今在ctDNA中检测低丰度甲基化位点仍然是一个重大挑战。现有的单管检测系统无法避免CRISPR/Cas12a切割导致的靶标耗竭，从而降低了检测灵敏度。

结果

本研究开发了一种基于温敏水凝胶的单管RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，结合了甲基化敏感的限制性内切酶（MSRE），用于检测乳腺癌ctDNA中的特定甲基化位点。该方法首次实现了在单管内同时进行空间分离和反应阶段之间的连接，且温敏水凝胶对两种系统均无抑制作用。该系统能够特异性识别甲基化靶标分子，检测限（LOD）低至1×10^-8 ng/μL（约70个拷贝/μL），性能优于现有的甘油增强型单管反应系统。该方法能够区分低至0.05%的甲基化片段，灵敏度是金标准甲基化特异性定量PCR（Methylight）的两倍。使用该方法对15名临床患者的肿瘤组织和配对血浆ctDNA进行检测，显示灵敏度和特异性均达到100%。

意义

这种新型的高灵敏度、高效且便携的检测方法通过温敏水凝胶介导的单管相分离技术，创新性地解决了传统RPA-CRISPR/Cas12a系统中CRISPR/Cas12a切割导致的靶标耗竭问题。它为准确检测低丰度甲基化循环肿瘤DNA（ctDNA）提供了新的技术途径，将显著提升乳腺癌液体活检的水平，并为乳腺癌的诊断和鉴别诊断提供有力支持。

引言

乳腺癌（BC）是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤[1]。目前，乳腺癌的筛查方法主要依赖于成像技术，这严重限制了早期病变甚至癌前病变的检测率。DNA甲基化在癌前病变阶段就开始了[2,3]。DNA甲基化的异常变化被视为癌症早期诊断、预后和治疗监测的潜在生物标志物[4]。基因组甲基化水平受环境和遗传因素的影响，并表现出区域性和种族特征[5]。循环无细胞基因组图谱（CCGA）研究显示，甲基化无细胞DNA（cfDNA）预测乳腺癌的敏感性为30.5%[6]。甲基化ctDNA可以识别预后不良的癌症类型，提供预后信息，并对高度侵袭性的癌症类型具有更高的敏感性[7]。

通过不同方法的自由组合，可以开发多种甲基化DNA检测方法，用于识别或获取甲基化DNA位点、核酸扩增方法和检测原理。亚硫酸钠处理[8,9]和TET酶转化[10]涉及复杂的程序和较长的处理时间。特别是亚硫酸钠处理会导致DNA显著降解，从而影响后续的阳性检测率。甲基化DNA结合蛋白方法[11]无法在单碱基水平上检测甲基化；相反，它更适合评估特定DNA区域的甲基化状态。MSRE方法[12]对碱基甲基化具有高敏感性，能够实现特异性切割[13]，并允许在单碱基水平上检测甲基化DNA。

目前，多种等温扩增技术已与CRISPR/Cas12a技术结合，用于高灵敏度检测核酸样本。其中，重组酶聚合酶扩增（RPA）[14,15,16]的操作要求较低（37–42 °C，15分钟），且不需要昂贵的大型PCR设备——这些特性使其特别适合与分子诊断工具CRISPR/Cas12a结合用于即时检测（POCT）[17,18]。尽管直接混合两种反应系统可以减少气溶胶污染，但可能会过早激活CRISPR/Cas12a的高效切割活性。这种激活会导致RPA扩增模板过度消耗，从而降低检测系统的灵敏度。目前，已经开发出多种方法来解决这一限制：Wang等人[19]构建的Cas12aVDet检测平台在RPA反应15分钟后通过离心将Cas12a（预先放置在反应管内壁）加入RPA系统，但缺点是需要额外的离心步骤。一些添加剂如甜菜碱[20]和DMSO[21]已被证明可以加速RPA反应速率，添加L-脯氨酸[22]可以提高Cas12a/Cas13a的检测能力；然而，这些方法都无法提高单管RPA-CRISPR/Cas12a系统的反应灵敏度。Yin等人[16]利用蔗糖的密度差异构建了动态水相反应（DAMR）系统，而Zhang[23]、Lu[24]及其同事利用甘油的粘度分离了RPA和CRISPR系统。尽管上述方法通过改变反应管中反应组分的排列在反应早期提高了检测系统的效率，但蔗糖和甘油在反应后期会在系统中扩散，降低所有反应组分的扩散速率和分子碰撞频率，Lin[25]的实验结果证实，甘油在反应后期扩散会对RPA扩增反应产生抑制作用。Zhao等人将琼脂糖凝胶与单管RPA-CRISPR/Cas12a反应结合使用。然而，琼脂糖凝胶对CRISPR/Cas12a系统和RPA系统本身都有强烈的抑制作用[26]，表明其生物相容性较差。同时，琼脂糖凝胶仅在45 °C时保持液态，难以在低温下与CRISPR/Cas12a系统融合；相反，在高温下融合会损害反应系统中的酶活性。因此，我们假设如果能够在单反应管中空间分离RPA系统和CRISPR系统，并在整个反应过程中不对任一系统产生抑制作用，这种方法将优于现有方法，进一步提高单管RPA-CRISPR/Cas12a系统的检测灵敏度。

一些温敏水凝胶材料为我们的策略提供了有力支持。我们研究团队的最新研究表明，这种混合水凝胶同时具有无细胞腹膜水凝胶的生物相容性和温敏性，以及海藻酸钠的机械强度[27]。然而，RPA-CRISPR/Cas12a系统中的Mg²⁺会与海藻酸钠交联，从而影响反应系统；因此，这种混合水凝胶不适合用于RPA-CRISPR/Cas12a系统。可塑的温敏羟丙基壳聚糖（HPCH）水凝胶表现出优异的凝胶性能：其在37 °C下的凝胶时间少于18秒，同时也具有良好的生物相容性[28]。此外，其微米级孔隙允许各种反应组分在RPA-CRISPR/Cas12a系统中自由扩散。与上述温敏水凝胶相比，纯无细胞腹膜水凝胶制备过程简单，也具有微米级孔隙，在4 °C时呈液态，并在37 °C时迅速凝胶。此外，腹膜水凝胶的生物衍生组分可以避免琼脂糖凝胶的缺陷，如抑制核酸和蛋白酶活性。因此，在本研究中，我们构建了一种基于温敏水凝胶的单管RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，结合了纯无细胞腹膜水凝胶和MSRE，用于检测乳腺癌ctDNA中的特定甲基化位点。

在本研究中，我们测试了由我们研究团队先前开发的诊断预测模型，该模型包括4个乳腺癌生物标志物[29]。在这些生物标志物中，FEZF2基因的甲基化区域与Illumina 450K甲基化阵列上的捕获探针cg20072171相对应。其hg19 chr3:62356944位置的甲基化区域包含适当的PAM（间隔序列），这使得可以设计用于Cas12a的crRNA。因此，选择该甲基化位点作为本研究的检测目标。

部分摘要

伦理声明

本研究方案已获得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准（批准编号：KY2022-65）。研究活动严格遵循国际人类研究保护标准，包括赫尔辛基宣言、贝尔蒙特报告、国际医学科学组织理事会（CIOMS）伦理指南和国际协调良好临床实践（ICH-GCP）指南。已获得书面知情同意。

MSRE结合RPA-CRISPR/Cas12a系统用于ctDNA甲基化位点检测的可行性分析和反应组分优化

为了验证MSRE结合RPA-CRISPR/Cas12a系统检测ctDNA甲基化位点的可行性，我们首先研究了MSRE的切割效率和RPA的扩增效率。图1A显示了MSRE切割位点的示意图及切割后产生的片段长度。RPA扩增产物被回收并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析（图1C）。结果显示，RPA扩增产物的长度和

结论

乳腺癌的早期筛查和诊断对于改善患者预后至关重要。开发高灵敏度和特异性的液体活检平台以准确捕获血浆中的低丰度甲基化ctDNA已成为精准肿瘤学领域的前沿方向[35,36,37,38]。本研究基于温敏水凝胶的独特性质，为RPA和CRISPR/Cas12a系统创造了空间隔离但反应相连的环境

CRediT作者贡献声明

Yajie Gong：方法学。Yuanyuan Yu：方法学。Xuquan Qin：资源。Hui Li：方法学。Youxue Zhang：方法学。Huawen Shi：方法学。Yanbo Chen：写作 – 审稿与编辑。Xianyu Zhang：写作 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。Jianxun Hou：写作 – 原稿撰写、方法学、数据分析。Yingjie Wang：方法学、数据分析。Weiguang Yuan：方法学

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

Jianxun Hou和Yingjie Wang对这项工作做出了同等贡献。本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：82073410, 82272623）、Petrel研究基金[资助编号：JJMS2022-03]以及哈尔滨医科大学附属医院的Nn10计划（资助编号：2017-02）的支持。