《Analytica Chimica Acta》：CADEM: Species-Level Detection of Mycobacterial cfDNA via CRISPR for Pulmonary Disease Diagnosis
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液体活检中基于CRISPR/Cas12a和微流控的CADEM系统可同步检测麻风分枝杆菌复合体、溶血性链球菌复合体和结核分枝杆菌，灵敏度较传统PCR提高10-100倍，2小时完成样本分析，解决传统培养法耗时长和非结核分枝杆菌诊断困难的问题。
朴承吉（Seungil Park）| 库邦汉（Bonhan Koo）| 金明圭（Myoung Gyu Kim）| 李恩英（Eun Yeong Lee）| 李孝珠（Hyo Joo Lee）| 罗延贞（Yeonjeong Roh）| 李敏珠（Minju Lee）| 白彩恩（Chae Eun Bae）| 李世元（Sei Won Lee）| 康英爱（Young Ae Kang）| 申勇（Yong Shin）
韩国首尔延世大学生命科学与生物技术学院生物技术系，邮编03722
摘要
背景
由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）引起的肺部感染由于症状重叠和治疗方法不同，给临床诊断带来了显著挑战。特别是，准确鉴定NTM物种（如鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex，MAC）和脓肿分枝杆菌复合群（Mycobacterium abscessus complex，MABC）至关重要，因为这些物种的药物敏感性特征与MTB有显著差异。然而，传统的基于培养的诊断方法耗时较长，且当前的分子检测方法分辨率较低，且严重依赖痰液样本。为了解决这些问题，利用细菌来源的循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）进行液体活检提供了一种微创替代方案，而CRISPR/Cas12a技术则提供了检测其微量水平的所需灵敏度。
结果
我们开发了CADEM（CRISPR-辅助检测方法，该方法通过微流控技术富集分枝杆菌来源的cfDNA）。该诊断系统集成了微流控cfDNA富集、靶向扩增和基于CRISPR/Cas12a的检测功能。微流控平台能够从大量临床样本中高效回收cfDNA，无需进行细胞裂解。优化的Cas12a–crRNA复合物能够高度敏感且特异性地检测MAC、MABC和MTB的特异性扩增产物，其灵敏度比终点PCR和基于探针的实时PCR高出10到100倍。在20个临床样本（7例阳性样本和13例健康对照组）的验证中，CADEM准确识别了所有MAC、MABC和MTB病例，且无假阳性结果。CRISPR检测步骤在20分钟内产生了清晰的荧光信号，结合富集和扩增步骤，整个流程在2小时内完成。
意义
CADEM提供了一种准确且高效的分子方法，可在物种水平上区分MAC、MABC和MTB，从而支持正确的诊断和治疗。通过将微流控cfDNA富集与基于CRISPR的检测相结合，CADEM能够从液体活检样本中高效分析肺部疾病。该系统还兼容等温扩增技术，为资源有限的场景下的即时检测提供了可能。
引言
结核病（TB）和非结核分枝杆菌肺部疾病（NTM-PD）是由分枝杆菌属细菌引起的肺部感染[1]。尽管两者具有相似的微生物学特征，但在传播方式、疾病进展和治疗反应方面存在显著差异[2]。尽管全球范围内正在努力控制结核病，但它仍然是一个重大的公共卫生问题[3]。结核病由结核分枝杆菌（MTB）引起，通过人与人之间的传播传播，而NTM-PD则由不具有传染性的环境分枝杆菌引起[4]。同时，在免疫功能低下和免疫功能正常的个体中，NTM-PD的发病率持续上升[5]。在结核病高发地区，即使AFB（抗酸杆菌）涂片显微镜检查无法区分MTB和NTM，患者也常被假设为结核病患者并开始接受经验性治疗。这种诊断上的重叠导致NTM-PD病例经常被误诊和不当治疗[6]。在NTM物种中，鸟分枝杆菌复合群（MAC）是最常见的，其次是脓肿分枝杆菌复合群（MABC）[7]。这些病原体在药物敏感性和耐药性方面与MTB有显著差异，因此准确鉴定其物种至关重要[8]、[9]、[10]。基于培养的诊断方法仍然是结核病和NTM的金标准，但由于MTB需要2到6周才能生长，NTM-PD通常需要多次阳性培养才能确认感染并排除环境污染[2]、[9]、[11]、[12]，因此这些方法耗时且劳动强度高。为了解决这些问题，越来越多地采用分子诊断方法与培养方法结合使用，以提供更快、更可靠的诊断结果。
分子诊断方法对于快速准确地诊断分枝杆菌感染至关重要，这对于及时开始治疗和有效控制疾病至关重要[9]、[14]。已经开发出嵌套实时PCR检测方法，可以在短时间内检测MTB及其耐药性标志物[15]。然而，像Xpert这样的广泛使用的检测方法仅适用于MTB检测，无法识别NTM，这限制了其在临床应用中的实用性。在MTB和NTB共感染的情况下，精确鉴定对于指导适当的治疗尤为重要[16]、[17]。大多数传统诊断工具还依赖于痰液样本，而某些患者群体难以提供高质量的痰液[13]、[18]。作为替代方案，分析循环游离DNA（cfDNA）的液体活检方法成为一种有前景的策略[19]、[20]、[21]。血浆或血清样本是cfDNA的微创来源，cfDNA由宿主细胞或感染期间的病原体（如细菌）产生的短DNA片段组成[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。cfDNA的一个关键优势是无需进行细胞裂解即可分离。然而，大多数商业试剂盒的标准协议中仍包含裂解步骤[30]、[31]、[32]。尽管cfDNA具有很好的诊断潜力，但其临床应用仍受到技术挑战的限制，包括病原体来源cfDNA水平低、提取方法相关的PCR抑制以及基于裂解的协议产生的背景噪音[33]、[34]。因此，开发灵敏且稳健的检测方法对于克服cfDNA诊断的技术挑战至关重要。
为了提高基于cfDNA的检测方法的诊断性能，CRISPR-Cas系统作为一种高灵敏度的分子检测平台应运而生。在其变体中，Cas12a因其双重酶活性而被广泛使用。当Cas12a识别到PAM（protospacer adjacent motif，通常为TTTV）序列时，它会引导CRISPR RNA（crRNA）与目标序列杂交，并切割目标DNA（顺式切割），随后切割单链DNA（反式切割），从而通过荧光报告基因的切割实现信号放大[35]、[36]。这种高灵敏度使得Cas12a能够被少量的目标DNA激活[35]、[37]、[38]。基于这一机制，CRISPR检测已应用于多种目标，包括细菌和病毒病原体[28]、[39]、[40]、[41]、[42]、单核苷酸多态性[43]、[44]、[45]以及血型基因分型[41]。然而，大多数现有的CRISPR检测方法依赖于从裂解样本中提取的DNA，这可能会引入背景噪音并降低分析精度。为了解决这个问题，最近的研究将CRISPR技术应用于通过液体活检获得的cfDNA。黄震（Zhen Huang）等人开发了一种用于检测血浆中MTB来源cfDNA的CRISPR检测方法[46]，林丽（Lin Li）等人随后将其应用于MAC检测[42]。尽管这些方法提高了灵敏度，但它们仍然依赖于基于裂解的提取流程，无法在同一诊断平台上同时区分MAC、MABC和MTB。
在这项研究中，我们开发了一种新的诊断系统CADEM（CRISPR-辅助检测方法，该方法通过微流控技术富集分枝杆菌来源的cfDNA，能够同时区分MAC、MABC和MTB。该系统将微流控cfDNA富集、靶向扩增和基于CRISPR/Cas12a的检测集成到一个高效的工作流程中，实现了高效且高灵敏度的分析。微流控芯片可以直接从临床样本中高效分离cfDNA，无需进行细胞裂解，减少了细胞碎片的背景干扰，并且即使是从大量样本中也能实现高产量的回收。富集后的cfDNA使用针对MAC、MABC和MTB的特异性引物进行扩增，扩增产物被Cas12a–crRNA核蛋白（RNP）复合物识别，从而触发荧光报告基因的反式切割，产生可读信号。通过对20个临床样本（包括7例确诊病例（2例MAC、1例MABC和4例MTB）和13例健康对照组）的验证，CADEM准确识别了所有阳性病例，无假阳性结果，灵敏度和特异性均达到100%。因此，通过将无裂解的cfDNA富集、病原体特异性扩增和CRISPR检测整合到一个2小时内完成的工作流程中，CADEM提供了一种准确、高效且微创的分枝杆菌肺部感染诊断方法。
材料与试剂
为了设计针对鸟分枝杆菌复合群（MAC）、脓肿分枝杆菌复合群（MABC）和结核分枝杆菌（MTB）的物种特异性检测方法，我们从NCBI GenBank数据库中获取了位于16S和23S rRNA基因之间的内部转录间隔区（ITS）序列（表S1）。五个质粒包含了鸟分枝杆菌（M. avium）、细胞内分枝杆菌（M. intracellulare）、脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的ITS区域
CADEM检测方法的建立
我们建立了CADEM检测方法（CRISPR-辅助检测方法，该方法通过微流控技术富集分枝杆菌来源的cfDNA，实现了MAC、MABC和MTB的物种水平检测（图1）。该系统包括三个连续模块：微流控cfDNA富集、目标特异性扩增和基于CRISPR/Cas12a的荧光检测。临床样本在微流控芯片中用同功能化学交联剂处理
结论
在这项研究中，我们开发了CADEM，这是一种集成了微流控富集、靶向扩增和CRISPR/Cas12a检测的cfDNA诊断系统，能够在2小时内识别和区分MAC、MABC和MTB。虽然大多数现有的分子检测方法依赖于从裂解细胞中提取的DNA，并受到样本类型、工作流程复杂性和背景污染的限制，但cfDNA提供了一种微创且无需裂解的替代方案
CRediT作者贡献声明
李孝珠（Hyo Joo Lee）：方法学、数据管理。罗延贞（Yeonjeong Roh）：方法学、数据管理。李敏珠（Minju Lee）：方法学、数据管理。白彩恩（Chae Eun Bae）：方法学、数据管理。李世元（Sei Won Lee）：资源支持。康英爱（Young Ae Kang）：写作——审稿与编辑、监督、资源管理、概念构思。申勇（Yong Shin）：写作——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。朴承吉（Seungil Park）：写作——初稿撰写、方法学研究、数据分析。
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府（MSIT）支持（项目编号：RS-2025-00513026、RS-2025-02192998和RS-2024-00341299）。
