基于天然树液的CRISPR-Cas12a辅助RT-RPA检测方法，用于特异性识别柑橘黄脉清除病毒

《Crop Protection》：Crude sap-based CRISPR-Cas12a-assisted RT-RPA assay for specific detection of citrus yellow vein clearing virus in citrus

柑橘黄脉澄清病毒（CYVCV）快速检测新方法。本研究开发并验证了基于CRISPR-Cas12a的RT-RPA技术，利用粗叶汁无需RNA提取即可在40-50分钟内实现特异性检测，灵敏度达10^-6稀释度，成本较传统RT-PCR降低1.4倍，适用于果园筛查和苗圃认证。

　　

Rakesh Kumar | Susheel Kumar Sharma | Nishant Srivastava | Pooja Bhardwaj | Sini Kumari | Abhinav Rawat | Viswanathan Chinnusamy | Virendra Kumar Baranwal | Nitika Gupta

印度新德里-110012，ICAR-印度农业研究所，植物病理学系，植物病毒学高级中心

摘要

Citrus yellow vein clearing virus (CYVCV) 是一种全球范围内新出现的柑橘病毒，常见于印度的柑橘果园中。早期检测 CYVCV 对防止其通过繁殖材料传播以及支持综合病害管理至关重要。传统的 RT-PCR 虽然可靠且被广泛使用，但耗时较长，需要 RNA 提取，并依赖于复杂的实验室设施，这限制了其在快速现场监测和大规模检测中的应用。在这项研究中，我们开发并验证了一种基于 CRISPR-Cas12a 的逆转录重组酶聚合酶扩增 (RT-RPA) 方法，使用粗叶汁作为模板，以实现快速、灵敏且序列特异性的 CYVCV 检测。从 CYVCV 的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 区域获得的 241 bp RT-RPA 扩增子能够被 Cas12a-crRNA 复合物特异性识别，从而激活荧光单链 DNA 报告基因的旁路切割，在 40-50 分钟内产生稳定且明确的信号。通过定量荧光测量，该基于 CRISPR 的系统的分析灵敏度可达到 10^-6 稀释度；而使用 UV 透射仪进行终点可视化则可达到 10^-3 稀释度。在具有症状的柑橘田间样本上的验证显示，感染植株显示出强烈的荧光信号（最高可达 91,447 AU），而健康和阴性对照样本则始终保持在基线水平。重要的是，感染样本在 UV 光下的可见荧光进一步凸显了该检测方法在实地应用的潜力。与传统 RT-PCR 相比，基于 CRISPR 的 RT-RPA 平台每样本的成本降低了约 1.4 倍，这一点通过详细的试剂成本分析得到了证实。这些特性使该检测方法成为一种稳健、用户友好且可扩展的 CYVCV 诊断工具，具有在苗木登记、果园监测和认证项目中的巨大潜力。

引言

Citrus 种类是全球重要的园艺作物，其生产力和市场价值受到嫁接传播病原体的严重限制，尤其是那些会降低植株活力、产量和果实品质的病毒和类病毒。其中，CYVCV 是一种属于 Mandarivirus 属（Alphaflexiviridae 科）的正链 RNA 病毒，最近被确认为一种检疫相关威胁，会在感染植株中引起特征性的叶脉透明化、斑驳和黄化现象（Loconsole 等，2012）。CYVCV 最早在 1988 年在巴基斯坦的柠檬 (Citrus limon) 和酸橙 (C. aurantium) 中被发现（Catara 等，1993；Grimaldi & Catara，1996）。随后在 1997 年，印度也报道了该病毒在多个柑橘品种中的存在，包括 Etrog 柠檬 (C. medica)（Loconsole 等，2012）。此后，该病毒在亚洲多个柑橘种植区被检测到，包括中国、土耳其和伊朗（Kumar 等，2024）。最近，在美国加利福尼亚州也确认了 CYVCV 的存在，对柑橘产业构成了严重的检疫风险（EPPO，2023；Sun & Yokomi，2023；Abrahamian 等，2024）。在南亚，最近的调查和病毒组学研究表明，商业品种如 Kinnow 柑橘 (Citrus reticulate) 中 CYVCV 的发病率正在上升（Pant 等，2018；Gupta 等，2024）。尽管传统的 RT-PCR、RT-qPCR 和 ELISA 等诊断方法因其稳健性和灵敏度而成为主流，但由于它们依赖于实验室设施、核酸提取和训练有素的人员，这些方法在快速现场筛查和大规模认证项目中的应用受到限制（Zhou 等，2017；Gupta 等，2024）。高通量测序 (HTS) 改进了新病毒和混合感染的发现和流行病学监测，但其高昂的成本和基础设施要求阻碍了其在现场诊断中的常规使用（Kumar 等，2024）。为了克服这些限制，开发了等温扩增技术，尤其是重组酶聚合酶扩增 (RPA)，因为它们可以在恒定的低温（通常为 37-42 °C）下扩增核酸，并能耐受粗植物提取物（Piepenburg 等，2006；Bhat 等，2022；Gupta 等，2024）。

RPA 适用于即时检测，因为它在恒定低温下快速运行。然而，与其他扩增方法一样，RPA 和 LAMP 容易出现非特异性扩增现象，如引物二聚体和脱靶产物，尤其是在使用无探针检测或侧向流动格式时。除非结合序列特异性探针或 CRISPR-Cas 12/13 等确认工具，否则这些伪阳性结果可能会产生误导（Ivanov 等，2020；Aman 等，2020；Ullah 等，2024；Warmt 等，2023）。基于 CRISPR 的检测系统通过将扩增与高度序列特异性的引导 RNA 指导的核酸酶识别相结合来克服这一限制。基于 CRISPR-Cas12a 的检测系统利用了 Cas12a 的独特性质：CRISPR RNA (crRNA) 指导的 Cas12a 核酸酶识别目标后，会激活非特异性的（“旁路”）单链 DNase 活性。当 Cas12a-crRNA 复合物特异性结合到 RT-RPA 扩增过程中产生的互补双链 DNA 目标上时，Cas12a 被激活并切割附近标记有荧光团和淬灭剂的单链 DNA 报告基因，从而产生可测量的荧光信号。这种依赖目标的旁路切割提供了比单纯等温扩增更高的序列特异性，从而减少了假阳性检测，实现了快速、灵敏且高度特异性的病原体检测（Chen 等，2018；Aman 等，2020）。特别是，Cas12a 表现出的目标激活的旁路单链 DNase 活性可以在正确扩增子的存在下仅切割荧光或侧向流动报告基因，显著提高了特异性，并简化了荧光或视觉读数的获取（Chen 等，2018）。RPA-CRISPR (Cas12a) 组合已成功应用于多种植物病毒，证明了快速、灵敏且适用于田间检测的工作流程（Aman 等，2020；Mahas 等，2021；Ramachandran 等，2021）。

基于我们之前开发的基于粗叶汁的 CYVCV RT-RPA 方法（Gupta 等，2024），该方法表现出高灵敏度和操作稳健性且样本处理要求低，我们在这里建立了一种集成的 CRISPR-Cas12a 辅助 RT-RPA 工作流程，用于快速可靠的病毒检测。该方法将 CYVCV RdRp 目标的等温扩增与 Cas12a 介导的序列验证和荧光报告基因切割相结合，从而减少了假阳性结果并在田间条件下提高了诊断信心。该检测方法在 40 至 50 分钟内提供结果，同时提供定量荧光读数和 UV 透射仪下的终点可视化。通过结合速度、灵敏度和序列特异性，该平台成为一种便携且成本效益高的柑橘病毒检测工具，适用于苗木登记、果园监测和认证项目。由于该方法使用粗叶汁作为模板，并依赖等温扩增和基于 CRISPR 的检测，因此无需常规实验室设施和复杂的仪器即可实施。工作流程只需要一个便携式干浴或加热块（37-40 °C）以及电池供电的加热装置进行孵育，再加上手持式 UV/蓝光光源或紧凑型荧光计进行信号读取。图 1 展示了用于 CYVCV 检测的 CRISPR-Cas12a 基础 RT-RPA 方法的工作流程示意图。

植物材料、核酸和粗叶汁制备

2025 年 8 月，从印度新德里 ICAR-印度农业研究所 (ICAR-IARI) 的果园中选取了四株 Kinnow 柑橘 (Citrus reticulate) 的幼叶，这些叶片表现出典型的叶脉透明化、斑驳和黄化症状。健康的温室培育、种子繁殖的 Kinnow 植株叶片作为阴性对照。田间样本中的病毒感染通过 RT-PCR 和测序得到确认（Kumar 等，2024）。

症状学和病毒确认

从 ICAR-IARI 的果园收集 Kinnow 柑橘样本以检测和分析 CYVCV。位于 Field 8B（28.643°N, 77.157°E）的植株表现出明显的病毒症状，包括叶脉透明化、斑驳和叶片黄化。受感染的叶片通常在中脉和侧脉处显示出透明的叶脉透明化，伴有不规则的黄化斑块和叶片活力下降（图 2A-B）。

讨论

本研究报道了结合 CRISPR-Cas12a 的 RT-RPA 平台用于柑橘作物中 CYVCV 的序列特异性检测。这些方法共同解决了 CYVCV 检测中的关键挑战。

在我们之前的研究中，RT-RPA 方法使用纯化的 RNA、粗叶汁或克隆的质粒 DNA 作为模板，在 40 °C 下 25 分钟内实现了 CYVCV 的快速扩增。该检测方法能够从 RNA 和粗叶汁制备物中检测到低至 10^-7 稀释度（相当于 0.1 pg/μl）的 CYVCV。

结论

本研究建立了一种快速、灵敏且成本效益高的基于 CRISPR-Cas12a 的 RT-RPA 方法，用于特异性检测 CYVCV。该方法实现了低至 10^-6 稀释度的荧光检测，在 40 至 50 分钟内提供明确的结果。通过将等温扩增与 CRISPR 介导的检测相结合，该平台具有高特异性、快速周转时间和对粗叶汁的兼容性，消除了对 RNA 提取的需求。

CRediT 作者贡献声明

Susheel Kumar Sharma：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目规划、方法论、资金获取、概念构思。 Nishant Srivastava：写作 – 审稿与编辑。 Pooja Bhardwaj：写作 – 审稿与编辑。 Sini Kumari：可视化、验证、方法论。 Abhinav Rawat：可视化、验证、方法论。 Viswanathan Chinnusamy：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目规划。

未引用的参考文献

欧洲和地中海植物保护组织，2023。

数据可用性

本研究中使用的序列可在 NCBI GenBank 数据库中找到，访问号为 OQ427642。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

涉及人类和动物的研究

本手稿中不包含涉及人类或动物的实验。

资助

本研究得到了印度政府 生物技术部 在“组织培养植物国家认证系统下的病毒索引中心”项目（项目代码：BT/AB/03/02/2021）的支持。此外，还得到了印度农业研究委员会 (ICAR) 和农业研究教育部 (DARE) 在印度农业研究所 (IARI) 主导项目“基因组编辑以改善资源利用”下的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者衷心感谢印度新德里 ICAR-印度农业研究所（ICAR）植物病理学系主任和主任提供的实验室设施和持续鼓励。