《Current Opinion in Biotechnology》：Harnessing plant natural products for enhanced biotic stress resistance
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这篇综述系统探讨了植物天然产物（PNPs）作为生态友好型生物农药的潜力。文章重点介绍了防御性PNPs的发现与生物合成途径解析的最新进展（如利用单细胞RNA测序/scRNA-seq等技术），并讨论了通过异源表达和增强植物体内（in planta）生产等策略应用这些化合物的方法。该综述为开发新型作物保护方案提供了重要理论依据和技术路径。
引言
植物与其生物胁迫因子（如病原体和害虫）在长期共进化过程中，形成了复杂的防御机制。植物天然产物（PNPs）作为专门化代谢物，在这一过程中扮演着关键角色。它们通常被划分为两类：组成型产生的植物抗毒素（phytoanticipins）和胁迫诱导产生的植物抗毒素（phytoalexins）。随着化学农药对非靶标生物和生态环境的负面影响日益受到关注，PNPs作为环保型生物农药的替代品受到了广泛重视。
植物的免疫系统通过识别病原体相关分子模式（PAMP）触发模式触发免疫（PTI），或通过细胞内核苷酸结合富亮氨酸重复受体（NLR）识别病原体分泌的效应子，从而引发效应子触发免疫（ETI）。防御性PNPs在此过程中通过直接毒性、信号传导或结构强化等多种机制发挥作用。例如，马利筋中的卡烯内酯（cardenolide）通过抑制昆虫Na+/K+-ATP酶来抵御帝王蝶幼虫；拟南芥中的芥酸酰胺（erucamide）通过靶向分泌系统抑制Pseudomonas syringae的毒力；水稻中的樱花素（sakuranetin）则通过抑制昆虫内共生菌和真菌病原体Magnaporthe oryzae的网格蛋白介导的内吞作用来提供防御。
值得注意的是，某些PNPs可能作为感病因子促进病原体毒力。例如，大戟和蒺藜苜蓿的皂苷（saponin）缺陷突变体对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）表现出更强的抗性。因此，利用PNPs的策略也包含通过基因沉默等手段抑制此类感病因子。
利用防御性PNPs的主要策略包括三类：一是通过激活生物合成基因或其调控元件来增强或修饰内源PNPs的产生；二是通过异源基因表达引入生物合成途径，使作物能够合成非天然的防御代谢物；三是外源施用PNPs作为传统化学农药的潜在替代品。
化合物与途径发现
PNP途径发现的工具与技术
PNPs生物合成候选基因的鉴定与表征通常依赖于组学技术（基因组学、转录组学、代谢组学）与分析工具（共表达分析、全基因组关联分析/GWAS）的结合。PlantiSMASH、WGCNA和MEANtools等计算工具在此过程中发挥着重要作用。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够提供细胞类型特异性的表达谱，已成为研究PNP生物合成、调控及其在植物体内精确定位的有力工具。例如，在棉花中，scRNA-seq揭示了棉酚类萜烯、单萜和倍半萜类防御代谢物定位于分泌腺细胞（SGC），并鉴定了调控该防御性萜类网络的SGC特异性转录因子（TF）。结合空间转录组学和scRNA-seq，研究人员在小麦中获得了对 Fusarium 感染的细胞类型视角的免疫应答，揭示了异黄酮、酚酰胺和苯并恶嗪酮途径在韧皮部、绿色组织及叶鞘组织中的协同激活。新开发的mpXsn策略（结合大规模多重扰动与单细胞转录组学）成功揭示了抗癌药物紫杉醇（taxol）前体——巴卡亭III（baccatin III）的若干生物合成基因。
多组学分析通过将酶编码基因与其代谢产物相联系，被证明是揭示PNP生物合成途径的有效策略。例如，联合转录组学和非靶向代谢组学分析鉴定了桃树在受桃蚜（Myzus persicae）侵染后积累的九种三萜类化合物；对唇形科植物的联合转录组、基因组和代谢组分析揭示了参与抗昆虫呋喃克罗烷（furanoclerodane）生物合成的细胞色素P450酶CYP76BK1同源基因的分布；在地涌金莲（Musella lasiocarpa）中，多组学整合揭示了苯基菲兰酮（PhPNs）的生物合成基因，并证明其具有抗尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的活性。
防御相关PNP研究的新发现
防御相关PNPs的生物合成途径发现通常始于组学分析以鉴定候选基因，随后进行异源表达和代谢物表征，最终通过功能实验验证。
近期研究发现，生物合成基因簇（BGCs）在植物防御中具有重要意义。例如，在面包小麦中鉴定并功能表征了病原体诱导的产生三萜类ellarinacin和黄酮类triticein的BGCs，以及产生未知二萜类化合物的簇；大麦中的一个BGC被证明指导了抗 Fusarium graminearum 的二萜类植物抗毒素——霍德丹（hordedane）的生物合成；另一个两基因簇则介导了抗昆虫和具有化感作用的生物碱——禾草碱（gramine）的生物合成，该过程涉及色氨酸的隐性氧化重排。
转录因子（TF）对代谢物生物合成基因的调控是一个活跃的研究领域。例如，水稻中的OsMYB1R是樱花素生物合成的转录激活因子；过表达OsWRKY10可增强稻壳内酯A（momilactone A）和B以及其它几种二萜类植物抗毒素的积累，从而提高对稻瘟病的抗性；拟南芥中的AtWRKY70是系统获得性抗性（SAR）所必需的，该过程由植物天然产物N-羟基哌啶酸（NHP）介导。
防御相关PNPs的代谢工程
通过遗传操作修饰植物内源防御化合物的生物合成
在鉴定关键基因后，可应用各种遗传操作方法来调控内源化合物的产生，包括RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas基因组编辑。例如，在博落回（Macleaya cordata）中，利用CRISPR/Cas9敲除一个竞争支路酶，成功将代谢流导向抗菌生物碱血根碱（sanguinarine）；在芥菜中，多重CRISPR介导的基因组编辑产生了低种子、高叶片硫代葡萄糖苷（glucosinolate）水平且保持野生型防御能力的品系。
反之，CRISPR激活（CRISPRa）可用于激活/增强防御化合物的生物合成。例如，在拟南芥MYB12突变体背景下，通过多重CRISPRa激活六个类黄酮生物合成基因，实现了细胞类型特异性生产黄酮醇（flavonol）；在番茄中，CRISPRa靶向SlPAL2启动子显著上调了SlPAL2表达，从而增强了木质素积累并赋予了对密歇根棍状杆菌（Clavibacter michiganensis）的增强抗性。RNAi同样可用于提高防御性PNP水平，例如稳定沉默大豆中的GmJAZ1导致植物抗毒素glyceollin的更高积累。
在异源植物中工程化防御化合物的生物合成
合成生物学使得将完整或部分生物合成途径引入不天然产生某种化合物的生物体成为可能。例如，将除虫菊酯（pyrethrin）途径从瓜叶菊（Tanacetum cinerariifolium）转移到番茄腺毛中，实现了这种天然杀虫剂的植物体内合成；将来自抗马铃薯早疫病（Alternaria solani）的马铃薯野生近缘种Solanum commersonii中的两个糖基转移酶基因导入感病的S. commersonii品系，诱导了新型四糖甾体糖生物碱（SGAs）的合成，从而增强了对早疫病和科罗拉多马铃薯甲虫的抗性。
系统优化本氏烟作为防御代谢物的生产底盘
本氏烟（Nicotiana benthamiana）不仅常用于途径发现，近期研究也致力于通过多种优化策略将其作为PNPs的生产底盘。例如，通过（1）引入高性能苯丙氨酸解氨酶（PAL）同工型AtPAL2，（2）通过2A肽连接共表达GmCHS8和GmCHR5以增强代谢流，（3）使用花青素途径阻遏蛋白AtMYB60重定向苯丙烷代谢，实现了大豆抗菌植物抗毒素异黄酮类glyceollin在本氏烟中的高产。有效的植物防御化合物异源工程化有时可能需要表达不止生物合成基因，如在N. benthamiana中工程化番茄来源的SGA所示。组装SGA生物合成途径需要表达具有葡萄糖醛酸基转移酶活性且充当蛋白质支架的GAME15，该支架促进几种酶形成内质网（ER）相关的SGA代谢区室（metabolon），从而提高了途径效率并限制了有毒中间体的积累。
用于大规模合成防御化合物的微生物途径工程
作为替代方案，生物合成途径可被工程化到快速生长的微生物中，在受控条件下合成防御化合物。与植物相比，微生物底盘具有生长快、细胞密度高、生物工艺成熟等优势，特别适合专门化代谢物的大规模生产。例如，具有抗昆虫和抗病原体特性的植物抗毒素马梅辛（marmesin）已在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大肠杆菌（Escherichia coli）中成功工程化，产量分别达到27.7 mg/L和203.7 mg/L。此外，具有精确调控功能的遗传电路可以缓解代谢瓶颈，例如Park等人在酵母中为芳樟醇（linalool）合成设计了一个四启动子电路，实现了40至500倍的动态范围。
结论与展望
PNPs的化合物与途径发现面临诸多障碍。许多PNPs产量痕量，难以检测；其合成往往仅在特定条件（如特定的生物胁迫或发育阶段）下被触发；且每种化合物通常仅是更广泛的防御相关化合物集合的一部分，因此其缺陷不一定导致感病表型，这使得通过抗性基因的正向遗传学方法发现其生物合成基因更具挑战性。在PNP应用于作物保护方面，还出现了一些非技术性挑战，如高开发成本，以及与转基因（GM）作物相关的公众接受度低和监管障碍。
新兴技术正迅速推动PNPs作为植物防御工具的发现与应用。AlphaFold已经增进了我们对植物-病原体相互作用的理解，并促进了具有增强抗病性酶的设计，凸显了其在途径发现和工程化（包括为PNP途径定制活性更高的酶）方面的潜力。同时，非靶向代谢组学不断发展，MetaboLights、GNPS/MassIVE和MSnLib等数据库的扩展为更有效地表征PNP途径铺平了道路。PlantMASST和Modifinder等工具分别有助于检测植物中代谢物的存在和预测结构修饰。在外源PNP应用方面，纳米颗粒递送系统展现出应用前景，如载有印楝素（azadirachtin）的纳米颗粒增强了黄瓜对棉蚜（Aphis gossypii）的抗性。
通过操纵PNP增强植物抗病性的可行性在几十年前就已得到证明，近年来在植物防御化合物的发现、其生物合成的解析以及在模式和作物植物中工程化生产方面取得了显著进展。尽管有这些进步，目前尚无商业栽培的作物品种是通过工程化植物专门化代谢物来增强抗病或抗虫性的。相反，获得监管批准的用于生物胁迫抗性的转基因作物实例（尽管也很少）仍然集中于其他获得性抗性机制，如表达病原体识别基因（R基因）、病毒外壳蛋白、细菌来源的蛋白质毒素或靶向害虫或病原体必需基因的RNAi。
鉴于丰富且 largely 未知的植物代谢组，发现新型生物活性防御化合物的潜力巨大。然而，要将植物化学防御的基础发现转化为商业应用，首先需要积累令人信服的田间试验证据，证明其持续有效性和农艺性能。最终，这些成功可能为作物保护提供可行且可持续的替代或补充传统化学农药的方案。
