《Gene Therapy》：CRISPR-AuNP: physicochemical optimization of a gold nanoparticle platform for cost-effective and modular non-viral gene editing in HSPCs
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本研究针对造血干细胞/祖细胞（HSPC）基因编辑中病毒载体和电穿孔技术的局限性，开发了一种模块化、低成本的金-聚合物杂化纳米颗粒（CRISPR-AuNP）平台。通过优化Cas9与金表面的相互作用机制，研究人员实现了Cas9、Cas12a及Cas12a-M29-1核糖核蛋白（RNP）的高效递送，在原发性CD34+HSPC中达到>10%的编辑效率且不影响细胞活性。该平台可在2小时内组装完成，成本低于70美元/百万细胞，为CRISPR技术在HSPC研究与治疗中的普及提供了新策略。
基因编辑技术CRISPR-Cas9自2012年问世以来，彻底改变了生命科学领域的研究范式，尤其在治疗遗传性疾病方面展现出巨大潜力。2023年，基于CRISPR-Cas9编辑的自体造血干细胞/祖细胞（HSPC）疗法Casgevy?相继在美国和英国获批用于镰状细胞病治疗，标志着基因编辑临床应用的里程碑。然而，当前HSPC的离体基因编辑仍依赖电穿孔技术，这一过程存在细胞毒性高、需专用设备、成本昂贵等局限，严重制约了其全球可及性。此外，病毒载体递送CRISPR组件可能因长期表达增加基因毒性风险，而脂质纳米颗粒（LNP）等非病毒递送系统在HSPC中易受细胞翻译活性低的限制。因此，开发安全、高效、低成本的非病毒递送平台成为领域内亟待突破的关键问题。
为解决上述挑战，Jennifer E. Adair团队在《Gene Therapy》发表研究，报道了一种模块化金纳米颗粒平台CRISPR-AuNP的优化策略。研究通过系统性优化Cas9 RNP与金纳米颗粒的物理化学相互作用，显著提升了基因编辑效率。关键技术方法包括：采用Turkevich法合成金纳米颗粒核心；通过动态光散射（DLS）和冷冻透射电镜（cryo-TEM）表征颗粒理化性质；使用硫醇化聚乙烯亚胺-聚乙二醇（PEI-PEG-SH）共聚物包裹RNP以增强内体逃逸；以原发性人CD34+HSPC（来自健康供体动员后采集）为模型，通过流式细胞术检测β2-微球蛋白（B2M）蛋白敲低，并通过DNA测序量化插入/缺失（indel）频率。
β2-微球蛋白作为模型靶点评估CRISPR-AuNP递效
研究以人B2M基因作为编辑靶点，其编码的细胞表面蛋白可通过流式细胞术快速检测编辑后蛋白表达缺失。通过gRNA筛选及电穿孔验证，最终选定靶向B2M外显子2的Cas9 gRNA 4用于后续纳米颗粒优化，该位点编辑后可导致54.7%的B2M蛋白表达丧失。
第一代CRISPR-AuNP中Cas9负载不足
初代CRISPR-AuNP采用硫醇化crRNA-trRNA双链锚定金纳米颗粒的策略，但SDS-PAGE分析显示Cas9核酸酶负载量几乎检测不到。进一步研究发现，低pH加载条件导致crRNA-trRNA双链解离，造成trRNA缺失（仅9.2条/颗粒），且共聚焦显微镜显示颗粒多滞留于细胞表面，无法有效内化。
第二代平台通过预组装RNP增强稳定性但内体逃逸不足
改进后的二代策略先将Cas9与gRNA预组装成RNP复合体，再在pH 3.8条件下连接至金纳米颗粒，使每颗粒负载量提升至39个Cas9 RNP。然而，尽管体外切割实验证实RNP活性保留，但共聚焦成像显示颗粒被困于内体中，且PEI-PEG共聚物涂层不足（N/P=0.5）导致编辑效率仅呈非显著趋势。
第三代CRISPR-AuNP通过聚合物优化实现高效编辑
研究进一步提出“先形成RNP-聚合物复合体，后连接金纳米颗粒”的三代策略。通过筛选不同PEG-SH嫁接率（2%-20%）的PEI共聚物，发现20%嫁接率（P20PSH）在N/P=2时可平衡编辑效率与细胞毒性。优化后颗粒直径约49 nm，负载35个RNP/颗粒，编辑效率提升至13.23%，且Cas12a与Cas12a-M29-1系统也分别实现15.07%和13.39%的编辑效率。
研究结论指出，第三代CRISPR-AuNP平台通过模块化设计解决了RNP负载稳定性与内体逃逸效率的瓶颈，在原发性HSPC中达到治疗相关编辑水平（>10% indel），且成本低于70美元/百万细胞。该技术无需特殊设备，2小时内即可完成组装，为资源有限环境下的基因编辑研究提供了可及性方案。未来通过靶向配体修饰或聚合物工程进一步优化内体逃逸效率，有望推动其在临床中的应用。
