免疫突触分子敲除的iPSC技术为通用型T细胞疗法提供广谱NK细胞抗性

《Regenerative Therapy》：Immune synapse molecules knockout in induced pluripotent stem cells enables broad NK cell resistance in T cell progeny

本研究针对异体iPSC来源T细胞(iT细胞)疗法面临的NK细胞免疫排斥难题，提出了一种创新策略。研究人员在已构建的低免疫原性iPSC平台(B2MKOCIITAKOPVRKO结合HLA-E过表达)基础上，通过CRISPR/Cas9技术双敲除免疫突触关键黏附分子CD54(ICAM-1)和CD58(LFA-3)，成功获得能抵抗多种NK细胞亚群攻击的iT细胞。体外实验显示dKO iT细胞对IL-15激活的NK细胞杀伤具有显著抗性，小鼠体内实验证实其持久性增强。该研究为开发通用型细胞疗法提供了新思路。

　　

在细胞治疗领域，异体诱导多能干细胞(iPSC)来源的T细胞(iT细胞)被誉为"现货型"疗法的希望之星，然而这颗新星在临床应用的天空中却始终被一片名为"免疫排斥"的乌云所笼罩。当来自他人的iT细胞进入患者体内，患者免疫系统会因人类白细胞抗原(HLA)不匹配而将其视为异物展开攻击。特别是当科学家们通过基因编辑敲除β2微球蛋白(B2M)等分子来隐藏细胞身份以躲避T细胞攻击时，却意外触发了自然杀伤(NK)细胞的"缺失自我"反应机制——这些免疫哨兵会将缺乏HLA-I类分子的细胞判定为异常细胞而格杀勿论。

面对这一困境，研究团队曾尝试多种策略，如过表达HLA-E来抑制NKG2A⁺NK细胞，或敲除PVR以避免DNAM-1识别。然而，NK细胞群体的高度异质性使得这些针对特定受体的策略难以提供全面保护。单个供体的NK细胞可能表现出多达6000种不同表型，这种惊人的多样性让"一招鲜"的免疫逃逸策略举步维艰。

正是在这一背景下，京都大学Shin Kaneko实验室的张静等研究人员独辟蹊径，将目光从传统的受体-配体互作转向了免疫突触这一更为根本的细胞接触界面。他们设想：如果无法完全"安抚"多样化的NK细胞，是否可以通过破坏它们与靶细胞之间的"握手"过程来实现更广泛的保护？这一创新思路催生了题为《免疫突触分子敲除在诱导多能干细胞中使T细胞后代获得广谱NK细胞抗性》的重要研究，发表于《Regenerative Therapy》期刊。

关键技术方法

研究团队从已建立的低免疫原性iPSC系( B2M^KOCIITA^KOPVR^KOHLA-E^O/E)出发，通过CRISPR/Cas9系统靶向敲除CD54和CD58基因，经流式细胞术和Sanger测序验证后，利用Notch信号通路引导的定向分化 protocol 获得iT细胞。功能评估包括：体外与健康志愿者来源的NK细胞共培养检测细胞毒性，CD107a脱颗粒实验评估NK细胞活化，流式细胞术分析免疫突触形成；体内采用hIL-15转基因NSG小鼠模型，通过生物发光成像观察iT细胞持久性。

3.1. 亲本低免疫原性iT细胞未能逃逸NK细胞介导的细胞毒性

研究人员首先评估了已建立的低免疫原性iT细胞平台的免疫逃逸能力。令人惊讶的是，尽管这些细胞具有B2M/CIITA/PVR敲除和HLA-E过表达的多重修饰，在与静止NK细胞长时间共培养72小时后，仍出现了超过40%的裂解。更严峻的挑战来自细胞因子激活的NK细胞：在IL-7+IL-15激活条件下，NK细胞在48小时内清除了80%以上的iT细胞。流式分析显示，虽然抑制性受体NKG2A(CD159a)在NK细胞上普遍表达，表明HLA-E过表达可能发挥了一定抑制作用，但激活受体DNAM-1的表达存在供体间变异，且PVR敲除可能同时削弱了TIGIT介导的抑制信号。这些结果揭示了现有HLA导向策略的局限性，特别是在炎症细胞因子丰富的移植微环境中。

3.2. 整合受体-配体分析确定CD54、CD58为iT细胞中的靶点

研究团队转变思路，聚焦于免疫突触形成这一更基础的环节。他们发现，NK细胞表面表达CD54的配体LFA-1和CD58的配体CD2的比例均超过95%，表明这两个通路在NK细胞中高度保守。与此同时，亲本iT细胞持续高表达CD54和CD58，为NK细胞识别提供了分子基础。这一发现为通过干扰免疫突触形成来实现广谱NK细胞逃逸提供了理论依据。

3.3. 生成黏附分子修饰的iPSC

利用CRISPR/Cas9技术，团队成功构建了CD54单敲除(CD54^KO)、CD58单敲除(CD58^KO)和双敲除(dKO)的iPSC系。通过流式细胞术和基因测序验证了靶向效率，确认了蛋白水平的敲除效果。

3.4. dKO iPSC成功分化为iT细胞

分化实验表明，CD54/CD58双敲除不影响iPSC向T细胞谱系的分化能力。第21天的CD4⁺CD8⁺双阳性细胞比例和数量与亲本组无显著差异。经过OKT3刺激和体外扩增后，dKO组也能正常产生CD8αβ⁺T细胞，且扩增倍数与亲本相当。重要的是，dKO iT细胞经CD19嵌合抗原受体(CAR)修饰后，对Nalm6、Raji等靶细胞的杀伤活性未受影响，证明其效应功能完好。

3.5. dKO iT细胞通过损害免疫突触形成在体外和体内逃逸NK细胞介导的细胞毒性

功能实验证实了研究假设：与亲本iT细胞近80%的被杀伤率相比，dKO iT细胞仅显示约30%的细胞毒性。机制研究表明，NK细胞与dKO iT细胞共培养后，CD107a表达显著降低，表明NK细胞脱颗粒反应减弱。更关键的是，流式细胞术检测显示NK细胞与dKO iT细胞的结合率明显下降，证明免疫突触形成受阻。小鼠体内实验进一步验证了这一效果：在hIL-15转基因NSG模型中，与NK细胞共注射的亲本iT细胞在2天内几乎被完全清除，而dKO iT细胞在第7天仍能检测到显著信号，其存活率与无NK细胞对照组相当。

研究结论与意义

该研究通过靶向免疫突触形成而非单个NK细胞受体通路，提出了一种创新且广谱的免疫逃逸策略。CD54/CD58双敲除有效破坏了NK细胞与靶细胞间的物理接触界面，从而克服了NK细胞受体异质性带来的挑战。这种"结构免疫逃逸"策略与现有的HLA导向方法形成互补，为开发真正意义上的通用型iT细胞疗法提供了新范式。

尽管该策略在增强存活方面表现突出，研究者也指出需关注黏附分子缺失对细胞迁移、内皮黏附和免疫细胞间通讯的潜在影响。未来研究可探索点突变等精准编辑方式，在保留生理功能的同时消除免疫识别。结合安全开关(如iCasp9)的引入，将进一步提升临床转化的可行性。

这项研究标志着iPSC衍生细胞疗法向通用型产品迈出了重要一步，为解决异体移植中的免疫排斥问题提供了新思路，为再生医学和肿瘤免疫治疗领域的发展注入了新动力。