《Nature Communications》：Development of a split-toxin CRISPR screening platform to systematically identify regulators of human myoblast fusion
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为解决人类肌肉发育调控机制不清的问题，研究人员开发了一种整合了人类成肌细胞模型、定制CRISPR文库和分裂毒素策略的高通量遗传筛选平台。该研究系统性鉴定了对人类成肌细胞融合至关重要的上游调控因子，发现多数命中基因汇聚于23个蛋白复合物，其中41个基因突变与人类肌肉形态异常疾病相关。这项工作为解析人类肌肉分化与融合的细胞自主性调控机制提供了可扩展的新方法。
肌肉是人体运动系统的核心组成部分，其正常发育对维持生命活动至关重要。然而，肌肉缺陷常见于人类发育性疾病，常导致严重的功能障碍。这些缺陷源于复杂的组织相互作用和罕见的基因突变，凸显了系统性鉴定调控人类肌肉生成（myogenesis）细胞自主性机制的必要性。尽管利用模式生物的研究揭示了骨骼肌生成的基本机制，但物种间遗传相互作用的差异可能导致对相同基因突变产生不同的表型反应。特别是大多数模式生物遗传多样性有限，可能在遗传异质性更强的人类群体中才会显现的基因功能被掩盖。这些局限性凸显了直接在人类系统中研究基因功能，以更好理解人类疾病分子基础的重要性。
近期，永生化人类成肌细胞已成为研究人类肌肉发育和疾病分子机制的有力系统。然而，用于解析这一过程中复杂调控网络的可扩展遗传工具仍然有限。为填补这一空白，研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，开发了一种创新的CRISPR筛选平台，为人类肌肉研究领域带来了突破性进展。
研究人员主要运用了几项关键技术：首先建立了来自7名供者多个解剖部位的人类永生化成肌细胞模型；其次开发了靶向6896个基因的肌肉特异性CRISPR敲除文库（MyoCRISPR-KOLib）；最关键的是设计了基于分裂毒素（split-toxin）的表型读出策略，通过白喉毒素A片段（DTA）的蛋白质反式剪接（intein-mediated protein trans-splicing）实现融合缺陷细胞的特异性富集；此外还应用了单细胞CRISPR与RNA测序联用技术（single-cell CRISPR&RNA-seq）和蛋白质相互作用网络分析等生物信息学方法。
验证用于研究人类肌肉分化和融合的细胞模型
研究人员首先评估了来自7名供者的人类成肌细胞系的肌肉生成潜力。这些细胞先前按照既定流程生成，从不同解剖部位、年龄和性别的骨骼肌活检组织中分离NCAM1+肌肉前体细胞，经过永生化处理并基于高肌肉生成潜力进行克隆筛选。分化指数范围为94.6%至98.7%，融合指数从90.7%至98.0%。时间进程RNA测序分析显示所有供者来源的成肌细胞中肌肉分化标志物（包括MYH1、MYH2、MYH3等）和肌肉融合因子（MYMK、MYMX）的表达迅速诱导。基因集富集分析（GSEA）显示，培养的人类成肌细胞的分子特征与体内人类胎儿肌肉分化程序高度相似。核型分析证实这些永生化人类成肌细胞即使在较高传代次数（20代）仍保持正常的二倍体基因组，为基因功能研究提供了理想的遗传模型。
为人类成肌细胞CRISPR敲除筛选量身定制的新gRNA文库
研究团队设计了一种更具成本效益且肌肉靶向的基因敲除gRNA文库，称为MyoCRISPR-KOLib。这个慢病毒CRISPR文库靶向6896个基因，这些基因在多个供者的人类成肌细胞中，在肌肉诱导前后均持续表达高于相对较低的阈值（TPM>1）。虽然该文库靶向的蛋白质编码基因数量仅为全基因组文库的三分之一左右，但所选基因 collectively 产生约90%在人类成肌细胞分化各阶段表达的所有人类蛋白质编码转录本。通过简单的成肌细胞适应性筛选，研究人员验证了MyoCRISPR-KOLib在靶向内源基因方面的功效，成功识别出419个对人类成肌细胞存活或增殖必需的基因和47个负向细胞周期调控因子。
用于高通量定量分析人类成肌细胞融合的合理设计表型读出策略
研究成功的关键在于能够富集表现出特定且可区分生物表型的突变体。成肌细胞融合代表骨骼肌发育和再生的关键步骤，是研究人类肌肉发生的相关且可量化的细胞表型。为实现融合缺陷突变体的选择性富集，研究人员将细胞融合与细胞存活选择耦合，开发了分裂毒素策略。该策略基于分裂白喉毒素A片段（DTA）与内含肽（intein）的结合，当两个分别表达互补毒素片段（DTAN-InteinN和InteinC-DTAc）的成肌细胞群体共培养时，细胞间融合允许通过内含肽介导的蛋白质剪接在合胞体内重建活性毒素，从而选择性杀死多核肌管。
概念验证：成肌细胞融合筛选发现大量新调控因子
利用该平台，研究人员进行了初步遗传筛选，系统性地识别人类成肌细胞融合的上游调控因子。该筛选发现了250个命中基因（FDR<0.1；p值<0.0035），其中14个是已知的肌肉生成基因，包括肌肉融合因子Myomaker（MYMK）、肌肉调控因子Myf5和MyoD，以及MyoD相关诱导因子（CUL3、p38）和辅因子（TCF12、p300）。研究人员通过两种互补方法验证了筛选结果：生成靶向前250个命中基因的聚焦CRISPR文库，在另外两种人类成肌细胞系和小鼠原代成肌细胞中重复基于分裂毒素的融合筛选；对125个随机选择的命中基因进行单独验证，证明这些基因的破坏导致未融合细胞比例显著增加。
成肌细胞融合筛选命中基因的高功能连通性和临床相关性
通过STRING分析构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，揭示了筛选命中基因间的1286个PPI，这些相互作用涉及160个融合筛选命中基因，聚类成23个蛋白质复合物。与人类医学数据库的交叉引用分析显示，41个融合筛选命中基因的突变导致以异常骨骼肌形态为特征的人类疾病。这些基因在图中用α标记。对融合筛选命中基因与小鼠表型组数据的平行交叉引用分析确定了48个基因，其突变导致异常产前生长/体重/体型，这些基因在图中用β标记。
单细胞CRISPR和RNA测序分析成肌细胞融合缺陷的细胞机制
研究人员应用基于分裂条形码的单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）来无偏倚地调查在我们融合筛选中存活的每个融合缺陷成肌细胞的转录组变化。采用表达常规gRNA和聚腺苷酸化gRNA的慢病毒CROP-seq构建体，允许同时进行CRISPR基因编辑和通过scRNA-seq检测gRNA。细胞聚类和表达分析确定了10个不同的簇，通过差异表达基因分析，确定了253个成肌细胞标志物和142个肌细胞标志物，这些基因用于计算单个细胞的基于表达的"肌肉分化评分（MDS）"。分析显示，用靶向MyoD-TCF12-p300辅因子复合物的gRNA转导的细胞分化评分最低，而带有Myomaker（MYMK）gRNA的细胞评分最高。用靶向其他蛋白质复合物的gRNA转导的细胞也显示出比表达MYMK gRNA的细胞降低的分化评分，表明在肌肉分化中存在更广泛的缺陷。
研究结论与意义
这项工作开发并验证了一种遗传筛选平台，通过高覆盖度筛选识别了大量先前未被认识的调控人类成肌细胞融合激活的必需因子。这些基因的CRISPR扰动在不同人类供者的各种肌肉组织来源细胞以及小鼠原代成肌细胞中均显示出成肌细胞融合表型。单细胞CRISPR和转录组分析能够通过利用大量基因标志物灵敏测量肌肉分化，提供比依赖少数肌肉生成标志物的常规方法更准确的评估。这些实验结果表明，许多成肌细胞融合筛选命中基因通过控制成肌细胞融合上游的更广泛肌肉生成程序来调控成肌细胞融合。
该研究建立的筛选平台不仅为定量和系统解析人类肌管形成上游调控因子提供了有力工具，还报告了一组有前景的候选基因，这些基因对人类肌肉生成和先天性肌肉疾病至关重要。扩展这种方法的应用将促进对以分化和融合受损为特征的肌肉疾病的遗传剖析。尽管取得了丰富的新发现，但研究也存在一些局限性，如由于人类成肌细胞固有的高融合指数（>90%），筛选可能更适合识别成肌细胞融合的负调控因子，且成肌细胞融合仅代表肌肉生成的一个狭窄时间窗口，无法揭示人类肌肉生成更早关键阶段的机制。
