《Current Opinion in Electrochemistry》：CRISPR-Integrated Electrochemical Biosensors for Precision Molecular Diagnostics
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本文综述了CRISPR-Cas系统与电化学传感器结合在生物分子检测中的应用，分析了信号放大、灵敏度提升及微流控整合对传统电化学传感器核酸检测的改进，探讨了人工智能在数据解析和诊断优化中的作用，并总结了商业化面临的挑战与未来发展方向。
Lorelai Schoch | Ryan Preska | Deependra K. Ban | Kiana Aran
徐坚-Gen Lay 生物工程系，雅各布斯工程学院
摘要
电化学生物传感器由于其快速性、经济性和便携性，在诊断领域，尤其是在即时血糖监测方面，取得了显著进展。尽管取得了这些成就，但将其应用扩展到检测DNA、RNA和microRNA仍然具有挑战性，主要原因是对核苷酸修饰的敏感性和特异性不足。在这方面，CRISPR-Cas系统通过提供精确且可编程的核酸（即DNA/RNA）识别能力，彻底改变了分子诊断技术。在这篇综述中，我们详细探讨了将CRISPR-Cas系统与电化学生物传感器结合如何提升生物分子检测能力。首先，我们概述了电化学传感的基本组成部分，然后讨论了在复杂生物环境中检测生物分子所面临的关键挑战。随后，我们描述了CRISPR-Cas系统的核心组成部分和分子机制，并探讨了这些机制如何被应用于电化学平台中以检测特定疾病的核酸（DNA和RNA），以及它们在蛋白质检测中的新兴潜力。接下来，我们介绍了通过信号放大、提高敏感性和微流控集成等方法来增强基于CRISPR的电化学传感的技术。此外，我们还讨论了人工智能在改进数据解释和提升基于CRISPR的电化学传感器诊断性能方面的作用。最后，我们讨论了实施基于CRISPR的电化学传感器诊断所面临的更广泛挑战，并总结了利用CRISPR-Cas技术开发经济、可扩展且精确的电化学诊断平台的未来前景。
引言
分子诊断技术，特别是特定疾病核酸生物标志物的检测，已经彻底改变了临床和公共卫生决策。从在大流行期间检测病毒基因组到识别遗传突变和监测癌症复发，核酸诊断技术提供了无与伦比的特异性和敏感性[1]、[2]。虽然传统技术（如实时聚合酶链反应（PCR）和下一代测序）非常准确，但它们需要复杂的仪器、熟练的操作人员以及耗时的工作流程[3]。这导致了在新突变检测方面的差距，尤其是在资源有限或时间敏感的即时护理（POC）应用中。
此外，COVID-19大流行凸显了开发快速、可靠且易于调整以应对变异株的分散式诊断工具的紧迫性。在这方面，电化学生物传感器因其低成本、便携性、快速响应时间以及微型化和数字集成的潜力而成为一种变革性的诊断工具[4]、[5]。这些传感器将化学和生物分子相互作用转化为电信号，从而实现定量和定性分析。然而，当应用于核酸诊断时，传统的电化学传感器在敏感性、特异性和稳健性方面存在局限性，尤其是在复杂的临床样本中[6]。这主要是由于它们依赖于核酸链的杂交，而目标分子的二级结构或碱基错配可能会阻碍这一过程[7]、[8]。在这方面，发现的一种名为CRISPR（规律间隔短回文重复序列）的细菌防御系统及其相关的Cas蛋白为克服这些挑战开辟了新途径[9]、[10]。
将CRISPR-Cas与电化学传感器结合可以创建一个协同平台，将CRISPR的生物识别和放大能力与电化学的实时、可扩展读数相结合（见表1）。这篇综述介绍了新兴的CRISPR集成电化学生物传感器的现状，强调了可能推动该领域朝着快速、便携和高度敏感的生物分子诊断方向发展的进展。我们还探讨了如何将人工智能引入这些平台以实现数据解释、多重检测和检测优化。我们进一步讨论了为广泛部署基于CRISPR的电化学传感器必须解决的技术和转化挑战。
1.电化学传感器设计与进展
一个标准的电化学生物传感器由三个电极组成：工作电极（WE）、参比电极（RE）和对电极（CE）（图1.A）。‘WE’被生物识别分子（如DNA/RNA探针、抗体、适配体或CRISPR-Cas复合物）修饰，以与特定分析物相互作用。‘RE’通常由Ag/AgCl或饱和甘汞电极组成，保持稳定的参考电位，而CE（通常是铂或碳）完成电路（图1.A）[19]、[20]。‘WE’上的生物分子相互作用通过循环伏安法（CV）、安培法和电化学阻抗谱（EIS）等技术转化为可测量的电信号[21]、[22]、[23]。
此外，电化学生物传感器的性能受到发生生化识别的界面的关键影响。为了减少非特异性结合或污染，可以使用纳米结构材料，如金纳米颗粒[24]、石墨烯[16]、[25]、[26]和碳纳米管[27]、[28]。这些材料增加了探针固定的表面积，促进了电子转移，提高了信噪比[18]。使用抗污染复合材料（如牛血清白蛋白（BSA）或两性聚合物）进行表面修饰，可以在复杂样本（如血液或唾液）中保持检测的完整性[12]、[28]。此外，微制造和丝网印刷电极的进步使得电化学传感器能够微型化和多重化[29]，允许同时检测不同的目标，从而提高诊断通量和可靠性[18]。例如，最近使用喷墨打印的纳米结构金电极与无电池NFC电位计结合，能够高灵敏度和快速周转率同时检测SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因，突显了基于CRISPR的多重检测技术在便携格式中的潜力[30]。
部分摘录
分类、关键组件和酶促机制
CRISPR-Cas系统是原核生物中的一种适应性免疫机制，旨在防御噬菌体感染。它由两个主要组件组成：Cas蛋白（作为可编程核酸酶）和工程化的引导RNA（gRNA），后者指导这些核酸酶与目标序列匹配。CRISPR系统分为两类：第一类使用多蛋白效应器复合物，第二类使用单一的大效应器蛋白[31]。
信号放大和灵敏度提升策略
尽管CRISPR-Cas12和Cas13酶通过其伴随切割活性具有内在的信号放大特性，即一个目标分子可以诱导许多报告分子的切割[37]、[41]。通过整合聚合酶链反应（PCR，如等温核酸扩增）和纳米材料沉积（例如Au–Fe3O4纳米颗粒），可以进一步增强这种放大效果。在一项研究中，实施这些放大方法提高了RNA的检测效果
商业努力和挑战
尽管在学术上取得了显著进展，但基于CRISPR-Cas的生物电子传感器的商业化仍然有限。唯一的显著商业进展集中在石墨烯场效应晶体管（gFET）平台上，该平台由Cardea Bio首创，后来被Paragraf收购，该公司开发了基于CRISPR和石墨烯的生物传感器和阻抗分析技术，随后CRISPR-QC获得了评估CRISPR配方用于基因编辑应用的许可[16]。除此之外，
结论与展望
CRISPR集成电化学生物传感器结合了酶的精确性和电信号的简单性，为诊断技术带来了变革潜力。CRISPR电化学系统因其多重检测能力和易于重新配置的特点而具有价值。未来的研究应集中在上游样本处理技术、AI引导的检测开发、多重CRISPR阵列、酶优化和法规协调上。随着持续的创新，这些生物传感器将进一步发展
贡献
这篇综述的想法由KA和DKB提出。LS在DKB和KA的指导下撰写了手稿。DKB、LS和RP收集了参考文献。LS协助获得了图表的使用权并提供了最终编辑。所有作者都对最终手稿提供了评论和反馈。
利益声明
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的竞争利益：
Kiana Aran报告称获得了美国国立卫生研究院（NIH）的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢NIH RO1 HL139605、NSF EAGER 316843-00001（加州大学圣地亚哥分校）、NSF EFMA 2526846以及加州大学圣地亚哥分校的Aims Project 2045293对本综述的财务支持。
