基于微同源介导的末端连接是埃及伊蚊中主要的DNA修复形式，对基因编辑、基因驱动和转基因移除具有重要意义

《Nucleic Acids Research》：Microhomology-mediated end joining is the predominant form of DNA repair in the mosquito Aedes aegypti with implications for gene editing, gene drive, and transgene removal

　　

可编程的位点特异性核酸酶已经彻底改变了遗传学领域，在蚊子媒介控制领域，通过这些工具进行的基因编辑激发了一波旨在预防疾病传播的种群控制新方法浪潮。尽管目前位点特异性基因编辑已十分普遍，但对于早在2亿多年前就已与最近的模式系统（果蝇属）分化的蚊子中DNA修复如何被优先考虑，人们知之甚少。在此，研究人员报告了一种可扩展的高通量平台，用于研究蚊子中的DNA双链断裂（DSB）修复，通过将CRISPR/Cas9、I-SceI或其他核酸酶递送至埃及伊蚊胚胎，能够测量单链退火（SSA）、非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导的末端连接（MMEJ）的修复结果。研究人员发现CRISPR/Cas9可以通过SSA修复诱导长达8.6 kb的缺失，并且能够耐受3.5 kb的切除距离。插入缺失（indel）事件对lig4敲除不敏感，并且在代表2个转基因品系中5个位置的20个合成向导RNA（sgRNA）中，几乎完全归因于MMEJ修复，确定MMEJ是埃及伊蚊中CRISPR/Cas9 DSB的主要修复形式。这一信息对于理解DNA修复如何塑造涉及基因驱动作用/抗性以及转基因稳定性的遗传控制策略所需的进程至关重要。

该研究针对埃及伊蚊这一登革热、寨卡病毒等主要传播媒介，深入探讨了其DNA双链断裂（DSB）修复机制，相关成果发表于《Nucleic Acids Research》。研究背景源于基因编辑技术在蚊子媒介控制中的应用日益广泛，但埃及伊蚊自2亿多年前从最近的模型系统（如果蝇）分化以来，其DNA修复路径的优先级尚不明确。现有研究表明，基因驱动（gene drive）依赖同源重组（HR）实现基因转换，而非同源末端连接（NHEJ）则常导致抗性等位基因积累致使驱动失败。此外，单链退火（SSA）虽被用于转基因移除，但其效率受限于断裂位置与同源序列的距离，且在埃及伊蚊中，微同源介导的末端连接（MMEJ）的作用长期被忽视。因此，解析埃及伊蚊的DSB修复偏好，对优化基因驱动效率和转基因稳定性具有重要科学意义。

研究人员开发了一种新型胚胎检测平台，结合高通量测序和生物信息学分析，系统评估了I-SceI和CRISPR/Cas9诱导的DSB修复结果。关键技术方法包括：构建携带684 bp同向重复序列的kmo^RG和1pc.-kmo^RGB转基因品系；设计多组sgRNA靶向不同距离的重复序列；通过胚胎显微注射递送核酸酶；采用纳米孔线性扩增子测序（Oxford Nanopore linear amplicon sequencing）和CRISPRessoWGS分析修复产物；利用lig4基因敲除品系验证NHEJ与MMEJ的贡献。

研究结果如下：

1. 1.
   量化kmoRG转基因诱变的SSA和indel：通过胚胎实验验证了I-SceI诱导的SSA效率（18%-21%）与既往生殖系数据一致，且SSA/indel比率约为1。CRISPR/Cas9可在距同向重复序列1.3 kb范围内有效触发SSA，但当距离增至3.5 kb时，SSA效率显著下降。
2. 2.
   Cas9/sgRNA诱变kmoRG的indel频率：indel事件主要由MMEJ驱动，表现为特定长度的缺失（如Δ9、Δ12），且与sgRNA靶位点周围的微同源序列直接相关。即使在不同实验中，相同sgRNA的indel谱仍高度相关（R²最高达0.865）。
3. 3.
   Lig4+和Lig4?胚胎中BR-KmoEx4的Cas9/sgRNA-D1诱变indel频率：lig4敲除（NHEJ缺陷）未改变indel谱，表明indel形成独立于NHEJ，进一步证实MMEJ的主导地位。
4. 4.
   1pc.-kmoRGB转基因的Cas9/sgRNA诱变：当靶位点距重复序列3.5 kb时，SSA效率极低（SSA/indel比率≤0.25），且不受靶位置影响，提示载体大小（cargo size）而非切除距离是限制SSA的主要因素。

讨论部分指出，埃及伊蚊的DSB修复以MMEJ为主导，这与人类、小鼠及果蝇中的发现一致，但挑战了传统认为NHEJ是主要竞争路径的认知。研究发现，Cas9诱导的indel多由2-12 bp的微同源序列介导，且不受DNA连接酶IV（Lig4）影响，表明MMEJ是产生抗性等位基因的关键机制。此外，SSA虽可移除长达8.6 kb的转基因，但其效率随切除距离增加而显著降低（>3 kb时极少发生），这为设计自消除基因驱动系统提供了关键参数。研究结论强调，通过规避重复富集的靶位点可减少MMEJ导致的基因驱动失效，而优化SSA路径则需控制载体大小。这些发现为蚊媒控制的基因编辑策略提供了理论基础，有助于开发更精准的基因驱动工具和可逆遗传修饰技术。