《Plant Biotechnology Journal》：Rewiring Steroidal Metabolic Pathways for Diosgenin Production in Solanum nigrum
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薯蓣皂苷元是合成皮质类固醇和性激素等甾体药物的关键起始原料。虽然目前商业上的主要来源是薯蓣属（Dioscorea spp.）块茎，但确定能够生物合成薯蓣皂苷元的替代植物宿主可提高其产量。本研究展示龙葵（Solanum nigrum）作为一种广泛分布的茄属物种，
薯蓣皂苷元是合成皮质类固醇和性激素等甾体药物的关键起始原料。虽然目前商业上的主要来源是薯蓣属（Dioscorea spp.）块茎，但确定能够生物合成薯蓣皂苷元的替代植物宿主可提高其产量。本研究展示龙葵（Solanum nigrum）作为一种广泛分布的茄属物种，可作为薯蓣皂苷元生产的新平台。龙葵在绿果中天然积累高浓度具有闭合F环（螺甾烷醇型）的甾体糖苷生物碱（SGAs），在叶片中积累具有开放F环（呋甾烷醇型）的甾体皂苷（STSs）。这两类化合物均源于胆固醇，共享早期氧化步骤，随后通过特定反应重定向不同的代谢流。在SGAs中，细胞色素P450酶SnGAME4将C26-OH氧化为醛，从而进行后续的转氨作用；在STSs中，3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶SnGAME25启动C5双键的还原反应。破坏这两个基因使代谢谱从天然的SGAs和STSs转变为呋甾烷醇型的原薯蓣皂苷糖苷。然而，这些开放的F环结构在酸水解过程中产率低。为克服这一限制，研究人员鉴定了内源性呋甾烷醇糖苷26-O-β-葡萄糖苷酶（F26Gs），并利用自发发酵将呋甾烷醇结构转化为螺甾烷醇结构。综上，龙葵绿果中薯蓣皂苷元的产量高达干重的1%。此外，研究人员将SnGAME4突变与增加果实数量的性状相结合对龙葵进行了工程化改造。这些结果确立了龙葵作为薯蓣皂苷元生产的有前景且可扩展的宿主。
论文解读：重编程龙葵代谢途径实现薯蓣皂苷元的高效生产
研究背景与立项依据
植物作为药用化合物的持久来源，为现代药理学奠定了基础。甾体类药物虽可通过半合成路线生产，但其关键中间体仍主要来源于植物。薯蓣皂苷元（Diosgenin）是一种衍生自胆固醇的化合物，长期以来一直是合成黄体酮和皮质醇等甾体激素的主要前体。随着全球对甾体药物需求的持续增长，对可持续且可扩展的薯蓣皂苷元生产平台的需求变得日益迫切。目前，薯蓣属（Dioscorea spp.）植物是工业薯蓣皂苷元的主要来源，例如黄姜（Dioscorea zingiberensis）块茎在水解后可达1%–3%的干重产率。然而，薯蓣属植物存在生命周期长（数年）、代谢产物集中于地下块茎以及遗传转化工具匮乏等瓶颈，严重阻碍了针对大规模改良的代谢工程努力。相比之下，龙葵（Solanum nigrum）作为一种茄科家族的野生一年生物种，具有生长周期短、易于进行基因组编辑以及在地上组织积累甾体代谢物的优势。值得注意的是，龙葵绿果中积累螺甾烷醇型的澳洲茄碱（Solasodine）类甾体糖苷生物碱（SGAs），叶片中积累呋甾烷醇型的原替告皂苷元（Proto-tigogenin）类甾体皂苷（STSs），且其苷元具有与薯蓣皂苷元相同的25R立体化学构型。鉴于龙葵具备天然的生物合成中间体且在结构和立体化学上与薯蓣皂苷元兼容，研究人员认为其是一个代谢预适应且遗传易处理的系统，适合重定向代谢流向薯蓣皂苷元生产。
主要关键技术方法
本研究主要采用CRISPR-Cas9基因编辑系统对龙葵中的三个SnGAME4同源基因进行三敲除突变体构建，并利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术靶向沉默SnGAME25基因家族。样本来源于龙葵（Solanum nigrum accession NIBRGR0000189638）及其二倍体近缘种美洲龙葵（S. americanum accession SP2273）和番茄（S. lycopersicum cultivar Sweet-100）。代谢物分析采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术结合多反应监测（MRM）模式进行定量。此外，研究还通过体外裂解液实验鉴定了内源性的呋甾烷醇糖苷26-O-β-葡萄糖苷酶（F26Gs），并结合自发发酵和酸水解流程优化提取工艺。
研究结果
2.1 SnGAME4三敲除突变体的生成
研究人员利用CRISPR-Cas9系统成功构建了两个独立的SnGAME4三敲除突变体系（Sngame4-1和Sngame4-2）。测序分析证实这些突变体存在移码突变。表型分析显示，突变体在开花时间、茎长和植株整体大小等与野生型（WT）相比无显著差异。
2.2 SnGAME4突变体重定向绿果代谢流向薯蓣皂苷元衍生物
LC-MS分析显示，野生型龙葵绿果中高积累澳洲茄碱糖苷（如α-澳洲茄边碱），而在Sngame4突变体中这些SGAs完全消失。相反，薯蓣皂苷元衍生物（如原薯蓣皂苷Protodioscin）在突变体中显著富集。通过保留时间和质谱碎片模式比对，证实了这些积累的化合物为呋甾烷醇型的薯蓣皂苷元糖苷。
2.3 薯蓣皂苷元衍生物的糖基化模式
质谱分析表明，在Sngame4突变体中新积累的薯蓣皂苷元衍生物保留了保守的C3位糖基化（如查科三糖），并在C26位额外连接了一个葡萄糖。这些化合物表现出典型的呋甾烷醇型皂苷特征，如[M-H2O + H]+离子峰，确认为原薯蓣皂苷糖苷。
2.4 自发发酵促进原薯蓣皂苷糖苷的呋甾烷醇向螺甾烷醇转化
自发发酵处理后，Sngame4绿果提取物中薯蓣皂苷元衍生物的保留时间向疏水性区域转移。利用Funlioside B（呋甾烷醇型）和Trillin（螺甾烷醇型）作为标准品进行诊断离子分析，证实发酵后样品中呋甾烷醇结构显著减少，螺甾烷醇结构大幅增加。
2.5 β-葡萄糖苷酶介导的呋甾烷醇向螺甾烷醇转化
利用β-葡萄糖苷酶抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）处理发现，GDL抑制了原薯蓣皂苷向薯蓣皂苷（Dioscin）的转化以及随后的酸水解产率。这表明内源性β-葡萄糖苷酶通过切除C26位的葡萄糖触发了F环的自发闭合。
2.6 催化呋甾烷醇向螺甾烷醇转化的β-葡萄糖苷酶的鉴定与功能验证
通过在美洲龙葵（S. americanum）基因组中筛选，研究人员鉴定了一组位于染色体6上的F26G同源基因（SaF26G.Ls和SaF26G.Gs）。在烟草（N. benthamiana）叶片中的瞬时表达实验表明，SaF26G.L1等蛋白能有效催化底物转化。进一步的VIGS实验证实，沉默这些SaF26Gs显著降低了裂解液将原薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷的能力，证明了其在结构转化中的必要性。
2.7 沉默SnGAME25重定向叶片代谢
由于龙葵叶片中高表达SnGAME25（催化C5双键还原），研究人员利用VIGS同时沉默六个SnGAME25同源基因。结果显示，沉默植株中替告皂苷元（Tigogenin）衍生物大幅减少，而薯蓣皂苷元衍生物（如脱水Uttroside B）显著积累，且糖基化模式未发生改变，表明代谢流被成功重定向。
2.8 通过代谢途径重编程提高薯蓣皂苷元产量
通过顺序流程（自发发酵、酸水解、分配和溶解）提取，Sngame4突变体绿果中的薯蓣皂苷元产量达到干重的约1%，与黄姜相当。在叶片中，沉默SnGAME25也显著提高了薯蓣皂苷元产量。在美洲龙葵中构建的Sagame4与Sagame25双突变体（TKO）进一步证实了同时破坏GAME4和GAME25具有叠加效应，能完全消除替告皂苷元并进一步提高薯蓣皂苷元积累。
2.9 在番茄中通过GAME4突变和GAME25沉默重编程代谢
在番茄中引入类似的遗传修饰（Slgame4突变结合SlGAME25沉默）导致新替告皂苷元（Neotigogenin）和原山药皂苷元（Proto-yamogenin）衍生物的积累。但由于番茄缺乏高效的25R构型特异性酶以及内源性F26G活性较低，其薯蓣皂苷元类似物的产率和转化效率远低于龙葵。
2.10 将SnGAME4突变导入果实发育增强基因型
为了提升生产力，研究人员将SnGAME4突变引入到携带COMPOUND INFLORESCENCE (S) 基因突变（s1/+ s2 s3）的龙葵背景下，该背景能显著增加花序分支和果实数量。结果表明，该工程株系在不影响植物生长的前提下，显著增加了果实生物量，从而有效提升了单株总薯蓣皂苷元的生产力。
讨论与结论
讨论部分指出，龙葵作为薯蓣皂苷元生产底盘具有多重优势：一年生短周期便于育种、遗传资源丰富、代谢产物积累于易于收获的地上组织、六倍体基因剂量效应有益以及关键的25R构型与薯蓣皂苷元一致。本研究通过破坏SnGAME4消除了SGAs，通过沉默SnGAME25减少了叶片中的C5还原产物，并结合内源性F26G酶（如SaF26Gs）及自发发酵工艺，成功将呋甾烷醇型糖苷转化为更易水解的螺甾烷醇型，最终实现了约1%干重的薯蓣皂苷元产率。与番茄相比，龙葵及其近缘种美洲龙葵具有更强的F26G活性，这可能与二者不同的化学防御策略有关。研究证明，在非模式宿主中重编程内源性途径是生产甾体药物前体的可行替代方案。通过整合代谢工程与发育优化（如结合S等位基因），为在龙葵中实现甾体药物前体的可持续高产建立了框架。该研究成果发表于《Plant Biotechnology Journal》。
