全球目前有2.54亿人患有慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染，每年因肝硬化和肝细胞癌（HCC）等并发症导致超过100万人死亡。尽管目前的强效直接抗病毒药物能够抑制HBV复制，但无法清除病毒，且极少能实现HBV功能性治愈，其定义为血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和DNA的消失。实现HBV功能性治愈的主要障碍是HBV共价闭合环状DNA微染色体（cccDNA），它隐藏在受感染细胞的细胞核中，逃避免疫系统监视，并且非常稳定。另一个障碍是不完整的HBV基因组整合到宿主基因组中，这是疾病后期HBsAg的主要来源，且在不影响人类基因组的情况下难以靶向。因此需要开发新的直接抗病毒药物，靶向HBV复制周期的不同阶段，包括HBV cccDNA和整合DNA，以提高功能性治愈率。基因编辑工具的发展为开发靶向HBV cccDNA、整合DNA和HBV RNA的新型疗法提供了机会。本综述探讨了用于靶向HBV cccDNA、整合DNA和RNA的不同基因编辑工具。
1. 引言
目前全球估计有2.54亿人患有慢性乙型肝炎病毒（CHB）感染，由乙型肝炎病毒（HBV）引起。CHB可导致肝硬化的发生和/或肝细胞癌（HCC），2022年这两者共同导致了超过100万人的死亡。HBV通过感染者的血液和体液（如唾液和阴道分泌物）传播。虽然预防性HBV疫苗可提供近100%的保护，但每年仍有120万例新的HBV感染发生。2021年，由乙型肝炎引起的肝癌占肝癌总数的42%以上，是全球肝癌相关死亡的主要原因。
目前的直接作用抗病毒药物很少能达到HBV功能性治愈，这主要是因为其作用靶点仅限于HBV复制周期的逆转录步骤，并未针对HBV共价闭合环状DNA微染色体（cccDNA）、整合的HBV DNA或病毒抗原，而这些正是实现HBV功能性治愈的主要病毒学障碍。学界普遍认为，需要开发新的直接作用抗病毒药物，靶向HBV复制周期的多个阶段，包括cccDNA和整合的HBV DNA，以抑制HBV抗原（包括HBsAg）的产生。
过去15年中基因编辑技术的重大进展为直接靶向HBV cccDNA和整合的HBV DNA提供了新的机遇。这些技术包括各种版本的CRISPR/Cas9，它们可以切割或编辑HBV cccDNA和整合的HBV DNA以防止HBV复制和抗原表达，以及用于沉默HBV转录的表观遗传编辑器。本文综述了靶向HBV的不同基因编辑技术，筛选了每种基因编辑工具的同行评审已发表文献，重点关注已进入临床试验的工具以及未发表的数据。
2. HBV生命周期
2.1 HBV基因组
HBV属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae），拥有10种基因型（A-J）。HBV包含一个3.2kb的部分双链松弛环状DNA（rcDNA）基因组，含有一条不完整的正链和一条完整的负链DNA。该基因组编码四个重叠的开放阅读框（ORFs）：核心（C）、X、聚合酶（P）和表面（S）。两条链均编码直接重复序列DR1和DR2，这对引发复制至关重要，同时也包含两个调节转录的增强子序列EnhI和EnhII。此外，HBV还具有四个启动子。
HBV基因组被转录成五种共末端（co-terminal）于其3'端的非剪接mRNA转录本。3.5kb的前核心mRNA（pcRNA）编码乙型肝炎e抗原（HBeAg）；3.5kb的前基因组RNA（pgRNA）编码HBV核心蛋白（HBcAg）和HBV病毒聚合酶蛋白（Pol）；2.4kb mRNA转录本编码大表面蛋白（L-HBs，含preS1、preS2和S基因）；2.1kb mRNA转录本编码中表面蛋白（M-HBs，含preS2和S基因）和小表面蛋白（S-HBs，仅含S基因）；0.7kb mRNA转录本编码HBV X蛋白（HBx）。
2.2 HBV蛋白
2.2.1 乙型肝炎表面（S）蛋白
包膜/HBsAg由三种蛋白组成：S-HBs、M-HBs和L-HBs。S-HBs包含“a”决定簇区域（氨基酸100-160），是HBsAg的主要抗原域。M-HBs的确切生物学作用尚不清楚，但其是病毒分泌所必需的，而非病毒感染性或组装所必需。L-HBs的N端被豆蔻酰化，插入脂质双层的疏水区域以介导病毒进入和释放。PreS1结构域与核衣壳相互作用以进行病毒组装，而preS1和preS2结构域均与钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）受体相互作用以介导病毒进入。所有表面蛋白均为42nm直径的有感染性Dane颗粒的组成部分。除形成Dane颗粒外，表面蛋白还构成了亚病毒颗粒（不含HBV基因组），其分泌数量远多于Dane颗粒。
2.2.2 乙型肝炎X蛋白（HBx）
HBx是维持HBV cccDNA处于转录活性状态以启动和维持HBV复制所必需的。HBx劫持含有DDB1的E2泛素连接酶，降解染色体结构维持（SMC）SMC5/6复合物，以增强cccDNA的病毒转录。HBx还直接与不同的转录因子相互作用，并作为不同病毒和细胞基因启动子的转录反式激活因子。HBx还在细胞质中刺激信号转导通路以促进病毒复制。研究表明，HBx的过表达可导致转基因小鼠发生肝癌。
2.2.3 乙型肝炎聚合酶蛋白（Pol）
90kDa的Pol蛋白包含4个结构域：末端蛋白（TP）、间隔区、逆转录酶（RT）和核糖核酸酶H（RNase H）结构域。TP结合pgRNA 5'端的ε结构，触发pgRNA和Pol被包装进病毒衣壳。逆转录在TP和pgRNA之间形成共价连接后启动。RT结构域包含DNA聚合酶活性位点，负责pgRNA的逆转录。RNase H结构域在逆转录过程中降解pgRNA。HBV Pol蛋白易出错的特性（缺乏校对能力）导致了准种池的产生，可能在不同选择压力下导致变异株（如耐药株）的选择。
2.2.4 乙型肝炎核心蛋白（HBcAg）
HBcAg的主要功能是形成核衣壳，但其也在调节逆转录和病毒分泌中发挥作用。HBcAg自我组装形成病毒衣壳，特异性地包装pgRNA和Pol蛋白。C端结构域对于结合pgRNA和调节逆转录至关重要。逆转录完成后，核衣壳与HBsAg相互作用形成新的病毒颗粒以供分泌。
2.2.5 乙型肝炎e抗原（HBeAg）
分泌的17kDa HBeAg并非HBV复制所必需。然而，它能促进病毒持久性，并具有免疫调节特性，可诱导体液和细胞介导的免疫反应，并与22kDa（p22）蛋白共同调节对病毒感染的先天免疫反应。
2.3 HBV复制
病毒进入肝细胞是由preS1区域的N端序列与NTCP受体结合触发的。rcDNA基因组被释放到细胞核中，Pol被释放（可能由宿主DNA修复酶TDP2介导）。正链由宿主DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶修复，形成cccDNA。cccDNA经历染色质化形成cccDNA微染色体，这是HBV的转录模板和储存库，也是病毒持久性的主要贡献者。cccDNA被宿主DNA聚合酶转录产生HBV mRNA，这些mRNA被运出细胞核并在那里翻译成病毒蛋白。Pol结合pgRNA的5' ε包装序列，两者一同被包装进病毒衣壳。这种结合也启动了负链的DNA合成。合成前四个核苷酸后，Pol/DNA复合物转位至位于pgRNA 3'区的DR1，Pol开始逆转录pgRNA形成负链DNA。Pol的RNase H结构域降解pgRNA，仅留下最后18个核糖核苷酸转位至负链5'端的DR2以合成正链DNA。随后发生第三次模板转换以使DNA环化形成rcDNA。然而，如果第二次转位步骤未发生，则会发生原位引发，产生双链线性DNA（dslDNA），后者可能整合到宿主基因组中。HBsAg、截短的HBx和HBeAg/HBcAg（可能由上游的细胞启动子表达）可由整合的HBV DNA产生。rcDNA或dslDNA可能被释放回细胞核以产生更多的cccDNA，特别是在缺乏L-HBs的情况下。否则，核衣壳将被表面蛋白包装并从细胞中作为新的传染性病毒粒子排出。
3. HBV临床意义与治疗
3.1 HBV临床结局
急性HBV感染者通常能清除病毒并产生针对HBcAg和HBsAg的抗体。然而，5-10%的成人和90%的婴儿急性HBV感染可能发展为慢性感染，此时HBV DNA、HBsAg和HBeAg持续存在于患者血清中。HBV被认为是非溶细胞性的，因为肝损伤主要由宿主介导的HBV感染细胞清除引起，特别是HBV特异性的CD8+ T细胞。其他导致HBV引起肝损伤的因素尚不完全清楚。持续暴露于高水平的HBsAg和HBeAg会导致T细胞和B细胞反应功能障碍，从而促进HBV的持久性。临床结果也受HBV基因型的影响，某些基因型可能导致严重的肝脏疾病。例如，在非洲，携带A1基因型的人群比携带D或E基因型的人群更容易发生HCC。干扰素（IFN）-α的治疗反应也可能受不同基因型的影响。核苷（酸）类似物（NUCs）治疗的反应在不同基因型间相似。
关于HBV治愈的讨论集中在开发完全/彻底治愈或功能性治愈上。完全治愈是指消除HBV，即检测不到HBsAg并消除HBV cccDNA和整合DNA。目前尚无治疗方法能达到完全治愈，这主要是由于缺乏能够准确定量cccDNA或整合HBV DNA的标准化检测方法或替代生物标志物。因此，完全治愈具有挑战性，全球共识认为功能性治愈是当前期望的治疗终点。功能性治愈是指患者血清HBV DNA和HBsAg水平无法检测到，伴或不伴抗-HBs血清学转换，且无明显的肝损伤。功能性治愈是一种罕见事件，每年发生在不到1-2%的慢性HBV患者中。此外，由于功能性治愈时肝内cccDNA和整合的HBV DNA仍然存在，特别是在免疫功能低下的患者中，可能会发生HBV再激活。为了实现功能性治愈，可能需要靶向病毒生命周期的多个步骤，包括cccDNA和整合的HBV DNA。
3.2 当前的HBV治疗
目前用于治疗HBV的药物类别包括NUCs和聚乙二醇化IFNα（pegIFNα），两者均用于预防肝病向肝硬化和HCC进展。目前的HBV治疗仅在少数患者中诱导功能性治愈，大约1-2%接受NUCs的患者和使用pegIFNα的患者中分别有高达20%能达到功能性治愈。
NUCs是目前唯一可用的抑制病毒复制的直接作用抗病毒药物，已有多种获批用于CHB治疗。然而，这些药物并不能完全根除HBV，因为它们不靶向HBV cccDNA微染色体库，也不能消除肝癌风险。此外，患者通常需要终身治疗（通常是每日一次）以防止HBV再激活，这在低收入和中等收入国家由于成本和可及性问题而难以维持。因此，迫切需要能够促进功能性治愈的有限疗程疗法。
PegIFNα是一种免疫调节剂，也用于CHB治疗，尽管不如直接作用抗病毒药物常用。对于HBV感染，pegIFNα治疗是有限的，作为皮下注射给药48周。与NUCs相比，pegIFNα治疗还与较低的HCC发生率相关。尽管pegIFNα在实现功能性治愈方面比NUCs更有效，但其应用受到严重副作用导致的耐受性差以及不同HBV基因型间疗效有限的制约，这凸显了对更有效且耐受性良好的有限疗程HBV治疗的需求。
3.3 新兴的直接作用HBV抗病毒疗法
由于要实现治愈需要靶向HBV复制周期的多个阶段，目前正在研究的新治疗方法包括靶向病毒进入、cccDNA、RNA中间体、衣壳形成和HBsAg分泌的方法。鉴于cccDNA和整合的HBV DNA是治愈的主要障碍，两者都应成为促进提高功能性治愈率的新治疗方案的主要靶点。目前已研究了多种基因编辑策略来靶向这些DNA亚型。
4. HBV DNA编辑
4.1 ZFN和TALENs
早期直接靶向HBV DNA的研究使用了锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）在体外和体内编辑HBV DNA。ZFNs由DNA切割结构域（如FokI限制性内切酶）与几个锌指蛋白偶联而成。这些锌指蛋白可以被设计用来识别特定序列，从而实现特异性。必须设计并递送一对基于FokI的ZFN才能在靶位点实现双链DNA切割。这些双链断裂可以通过非同源末端连接（NHEJ）修复，这是一种易错的修复方式，会导致插入和/或缺失（indels）突变，从而使靶标失活。
在Huh7细胞中，靶向C ORF的ZFNs在与ZFNs和1.3mer HBV质粒共转染3天后，将pgRNA降低了29%。在表达HBV的稳定细胞系HepAD38细胞中，腺相关病毒（AAV）递送的ZFNs显著降低了细胞和分泌的HBV DNA水平，分别降低了约95%和90%。利用基于FokI的ZFNs的一个主要优势是二聚化对切割至关重要，这限制了脱靶编辑的可能性，因为需要识别两个不同的序列。
其他基因编辑研究使用了TALENs，其比ZFNs更具特异性、效率和更低毒性。与ZFNs类似，TALENs也连接有限制性内切酶（常见为FokI），但酶是与转录激活样效应因子（TALE）融合而非锌指蛋白。两个氨基酸（重复可变双残基）负责特异性。与ZFNs一样，这些双链断裂可以通过NHEJ修复。
在靶向HBV方面，TALENs破坏cccDNA以降低稳定细胞系HepG2.2.15细胞中的HBsAg水平，并在流体动力学注射的NMRI小鼠模型中将病毒颗粒当量、HBsAg和HBcAg水平分别降低了高达约70%、>90%和约80%。将TALENs与IFN-α联合使用增强了其抗病毒效果，突显了联合治疗的益处。强制性异二聚体TALENs减少了脱靶切割，并降低了流体动力学注射的NMRI小鼠中的HBV蛋白表达和复制标志物。在证明通过脂质纳米粒（LNPs）递送TALENs mRNA可在多种细胞培养模型中实现HBsAg敲低后，Smith等人将TALENs作为mRNA在脂质纳米粒中递送至转基因小鼠，在LNP给药后15天，血清HBsAg和HBV病毒颗粒当量分别减少了约40%和>99%。通过LNPs递送TALEN mRNA导致瞬时表达，这可能有利于减少脱靶编辑，但可能会限制长期疗效，因为与对照组相比，注射后第8天至第15天血清HBsAg水平有所上升。这种上升可能是病毒反弹的迹象。未来的研究应在注射LNPs后更长时间内监测小鼠，以评估TALENs的长期效果。
虽然ZFNs和TALENs方法实现了HBV复制标志物和蛋白质的敲低，但它们在体外并不如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）9特异。
4.2 非同源末端连接CRISPR/Cas9
基因编辑工具CRISPR/Cas已成为HBV DNA基因编辑的首选。来自CRISPR II类系统的Cas9蛋白经常被用于基因编辑，其中化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（spCas9）是最常用的直系同源物之一。使用单一引导RNA（sgRNA），它由含有间隔序列的3' CRISPR RNA（crRNA）人工融合到5'的反式激活crRNA（tracrRNA）（支架RNA）组成。Cas9蛋白利用的间隔序列与靶基因的靶序列（原间隔序列）互补。Cas9蛋白包含两个核酸酶结构域：组氨酸-天冬酰胺-组氨酸核酸酶结构域和类RuvC结构域。靶DNA中有两个位点促进位点特异性切割：原间隔序列和原间隔序列邻近基序（PAM），后者对切割至关重要。不同的Cas9直系同源物识别不同的PAM序列并具有不同的间隔长度。CRISPR/Cas9也可用作基因编辑工具，因为可以改变间隔序列以允许对任何靶DNA的特异性。与ZFNs和TALENs一样，Cas9可导致NHEJ，随后引入indels，破坏基因表达。
4.3 NHEJ CRISPR/Cas9靶向HBV DNA
大量研究使用NHEJ CRISPR/Cas9在细胞培养、小鼠和树鼩模型中靶向HBV DNA。这些研究显示HBV蛋白表达和复制标志物降低，证明了其作为新型HBV治疗方法的潜力。令人鼓舞的是，据报道一些Cas9和sgRNA组合降低了cccDNA水平，这是迈向彻底治愈的重要一步。
由于HBV基因组高度重叠，一个sgRNA可以同时编辑多个HBV ORF。一些sgRNA靶向增强子元件并随后编辑重叠的ORF。
除了减少HBV复制标志物和蛋白质表达外，还研究了NHEJ CRISPR/Cas9靶向HBV DNA对肿瘤发生和关键肿瘤特征的影响。一项研究表明，靶向PreS1和PreS2的sgRNA还可以将具有整合HBV DNA的几种细胞系中的细胞增殖降低约50-70%。在皮下注射携带HBV DNA整合子的肝癌细胞系PLC/PRF/5的无胸腺小鼠中，表达靶向sgRNA的小鼠与对照细胞相比，中位肿瘤重量和体积减少了高达约95%，肿瘤大小以及细胞增殖标志物KI-67减少了高达约90%。虽然使用的体内模型不能反映实际的HBV感染，但它展示了Cas9在减少HBV蛋白表达方面的潜力，以及减少肿瘤进展的潜力。随后的一项研究使用了X ORF靶向sgRNA，在HepG2.2.15细胞中将HBx mRNA降低了>95%，分泌的HBsAg和cccDNA降低了2倍，还减少了细胞迁移、趋化迁移、侵袭和集落形成，表明致瘤特性降低。在HepG2.2.15细胞中敲低HBx导致波形蛋白、上皮间质转化标志物、CD133、间质基因、β-连环蛋白、TGF-β、基质金属蛋白酶和癌症干细胞标志物下游减少。下调幅度最大的基因包括与代谢、组蛋白修饰、病毒感染、细胞过程和信号转导相关的基因。在他们的3D肿瘤模型中使用X ORF靶向sgRNA转染导致HBx mRNA降低2.57倍，cccDNA降低1.6倍，以及上述基因的转移。这两项研究展示了利用CRISPR/Cas9靶向HBV DNA并减少癌症形成的潜力，这对于那些疾病进展晚期的患者可能是一种有前景的治疗方法。
尽管大多数研究利用spCas9直系同源物，但其他Cas9直系同源物已被用于靶向HBV DNA。由于不同的Cas9直系同源物具有不同的PAM，它们提供了新的潜在HBV DNA靶标。不同Cas9直系同源物的主要优势在于其PAM的长度和复杂性，这可以减少脱靶编辑。例如，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Cas9（saCas9）具有5' NNGRRT 3' PAM，而spCas9具有5' NGG 3' PAM，因此saCas9 PAM出现的频率低于spCas9 PAM，尽管这也减少了可能的靶位点数。多项研究使用不同的Cas9直系同源物来降低HBV蛋白表达和复制标志物。一项研究比较了体外spCas9与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）Cas9（stCas9），后者识别PAM 5' NNAGAAW 3'。spCas9和stCas9靶向HBV DNA均在体外实现了pgRNA（分别高达93%和>93%）、S-RNA（分别高达92%和>93%）、HBsAg（分别高达78%和73%）和HBcAg（最大无非阳性细胞）的敲低。Kostyushev等人还研究了Cas9系统靶向甲基化cccDNA的影响，这可能会降低切割效率。分析Cas9靶向甲基化HBV DNA的情况很少进行。使用转染到HepG2细胞中的甲基化重组cccDNA（rcccDNA），结果显示spCas9和stCas9可以将rcccDNA水平分别降低约65%和约80%（与模拟对照相比），尽管一些sgRNA的切割效率受到甲基化的负面影响。与模拟对照相比，spCas9在10个分析的脱靶位点中的4个引入了indels，而stCas9在10个分析的脱靶位点中没有引入indels。这显示了使用不同Cas9直系同源物的潜在益处，特别是在减少脱靶编辑方面。
4.4 NHEJ CRISPR/Cas9切口酶
虽然NHEJ CRISPR/Cas9具有很高的特异性，但仍可能发生脱靶编辑。决定脱靶编辑可能性的因素包括间隔序列与原间隔序列之间的错配数量、错配的位置以及错配内的特定碱基。最多可容忍五个错配，尽管增加错配数量会降低效率。间隔序列中的缺失或插入以及这些缺失或插入与核苷酸错配的组合已被发现是可以容忍的。脱靶编辑的水平也与序列有关。这种对原间隔序列和间隔序列之间差异的容忍度引发了人们对将NHEJ CRISPR/Cas9用作HBV治疗时可能发生脱靶编辑的担忧。
为了减少NHEJ CRISPR/Cas9系统的脱靶编辑，已经测试了一种分裂Cas9系统。nCas9（RuvC样结构域中的D10A突变）不会导致双链断裂，而只在一股链中引入切口。同时递送两种不同的sgRNA与nCas9一起，在两股链中引入单链切口，类似于基于FokI的ZFNs和TALENs。这种方法在HepG2-hNTCP-C4细胞中降低了HBcAg和细胞内rcDNA（约50%）。这种方法的主要缺点是需要将sgRNA设计在彼此靠近的位置，由于需要两个PAM，限制了潜在的靶位点。此外，同时递送多个sgRNA对可能对nCas9造成过大的负担，无法在每个靶位点实现最大切割，从而影响HBV敲低效果。
4.5 NHEJ CRISPR/Cas9 sgRNA组合
虽然上述研究表明单个sgRNA可以抑制HBV复制标志物和蛋白质表达，但由于基因型、准种或可能的逃逸突变体的病毒多样性，敲低水平可能会受到影响。因此，可能需要组合sgRNA以防止通过多重化或顺序递送发生的病毒逃逸。
多项研究利用多重sgRNA靶向HBV DNA。一项研究显示，与单重相比，多重sgRNA时分泌的HBsAg和HBeAg分别显著降低了65.5%和86%。在转染了1.2mer HBV质粒的Huh7细胞中，多重sgRNA在两个靶序列之间切割HBV DNA并将其从基因组中切除。在HepAD38细胞中，多重sgRNA显著降低分泌的HBsAg、HBeA
