富士镰刀菌(Fusarium fujikuroi)CRISPRi系统的开发及其在赤霉素(gibberellic acid)生产中的应用

《Engineering Microbiology》：Development of a CRISPRi system in Fusarium fujikuroi and its application in gibberellic acid production

　　

基因敲降是一项关键的遗传操作技术，尤其适用于靶向致死基因或产物合成途径相关基因（此时完全基因敲除不可行）。该方法在多核物种（如富士镰刀菌Fusarium fujikuroi）中尤为有价值，因为在这类物种中获得均一的基因敲除株极具挑战。为克服这些局限，研究人员首先筛选了一组抑制结构域(repression domains, RDs)，随后利用最优候选元件构建了针对F. fujikuroi的CRISPR/dCas9介导的敲降平台。通过靶向erg9（编码角鲨烯合酶，麦角固醇生物合成甲羟戊酸途径的第一个承诺酶），研究人员成功将部分代谢通量从甾醇生产重定向至赤霉素(GA)生物合成。该策略在保持表型正常生长的同时，最小化了碳流至竞争途径的损失。此外，利用CRISPR/dCas9介导的脱氢酶基因des敲降，使GA4产量提高2.62倍，并消除了中间产物GA7，获得了专产GA3+4的菌株，实现了代谢谱的精细调控。利用该CRISPRi系统，研究人员实现了erg9 mRNA水平降低70–89%，des mRNA水平降低67–84%。研究结果表明，该研究建立了一个定制的CRISPRi平台，可有效实现F. fujikuroi的基因抑制。

论文解读：富士镰刀菌CRISPRi系统的开发及其在赤霉素生产中的应用

研究背景与意义

富士镰刀菌（Fusarium fujikuroi）是工业上生产赤霉素（Gibberellic Acids, GAs）的重要丝状真菌。赤霉素作为植物激素，广泛调节植物生长，其中GA₃、GA₄、GA₇等具有高生物活性。目前工业生产主要依赖F. fujikuroi发酵，其GA合成与甾醇、类胡萝卜素等共享前体法尼基焦磷酸（FPP）。然而，F. fujikuroi为多核菌丝体，传统CRISPR/Cas9基因敲除难以获得均质突变株，且对于必需基因（如甾醇途径的erg9）无法实现完全敲除（致死）。面对这些瓶颈，研究人员引入CRISPR干扰（CRISPRi）技术，即利用催化失活的dCas9结合真核生物抑制结构域（Repressor Domains, RDs），在不改变基因组序列的前提下实现可调控、可滴定（titratable）的基因转录抑制，特别适合多核真菌及必需基因代谢通量微调。本文发表于《Engineering Microbiology》。

主要关键技术方法

研究人员以野生型F. fujikuroi（由浙江钱江生化提供）为宿主，大肠杆菌DH5α为质粒克隆宿主，酿酒酵母BY4742为RDs来源。首先对Cas9进行点突变（D10A/H840A）构建dCas9，随后将源自酿酒酵母的7种转录抑制结构域（RD1–RD7）分别融合至dCas9的C端，利用F. fujikuroi自定义启动子（PgpdA驱动dCas9，5S rRNA启动子驱动sgRNA）构建CRISPRi表达框，以潮霉素/博来霉素为筛选标记。通过原生质体PEG-CaCl₂转化导入质粒。靶向基因为erg9（角鲨烯合酶，甾醇途径入口）和des（GA₄→GA₇脱氢酶）。通过qPCR检测mRNA敲降效率，HPLC定量GA₃、GA₄、GA₇及麦角固醇，测定最小抑菌浓度（MIC）及生物量（DCW），以野生型为对照进行生物学重复与统计学分析。

研究结果

3.1 开发F. fujikuroi定制CRISPR/dCas9基因敲降平台

研究人员构建了含dCas9与sgRNA表达框的质粒，测试了7种酵母源RDs。以des为报告靶点，通过发酵GA₃产量评估抑制效果，发现RD4（源自酿酒酵母MIG1，通过招募Tup1-Cyc8及组蛋白去乙酰酶建立抑制性染色质）效果最优，使GA₃降至1.16 g/L（降低39.2%）。无sgRNA对照（dCas-RD4）与野生型无差异，排除RD4非特异性代谢干扰。结果表明，dCas9-RD4融合显著增强真核环境下的转录抑制。

3.2 des抑制效率定量及其对GA代谢的影响

qPCR显示dCas9-RD4靶向des可使mRNA降低67–84%（P < 0.0001）。发酵结果显示，所有转化子完全消除GA₇，GA₄最高提升2.62倍，GA₃因前体分流略降。由此获得专产GA₃₊₄的工程菌株，实现了GA代谢中间体的精细调控。

3.3 以erg9为靶点的基因沉默

erg9为必需基因，完全阻断致死。CRISPRi部分敲降使erg9 mRNA降低70–89%，麦角固醇仅降40.7%，菌株生长（DCW）正常。GA₄提升5.05倍，GA₇提升1.87倍，GA₃提升18%，总GA（GA₃₊₄₊₇）达2365 mg/L（提升23.5%）。双靶点（erg9+des）菌株消除GA₇，GA₄达150 mg/L，总GA较单靶des敲降提升37.3%，但因GA₃略减未超过野生型总产。证明部分分流甾醇前体可有效增强GA合成。

3.4 erg9敲降菌株的性状表征

麦角固醇定量显示敲降株降低至多40.7%；MIC实验显示对两性霉素B敏感性下降（MIC由3.125升至6.25 μg/mL），对氟康唑敏感性上升（由200降至100 μg/mL），符合ERG9部分抑制表型。生长曲线显示生物量无显著变化，证实部分erg9敲降在维持细胞活力的同时实现代谢通量重排。

讨论与结论总结

传统CRISPR/Cas9在多核F. fujikuroi中易受核异质性影响，常残留未编辑野生型核，且必需基因无法敲除。CRISPRi通过dCas9-RD4复合体在核内实施转录抑制，不受基因组编辑均一性限制，可实现稳定、可滴定的基因敲降。本研究筛选发现RD4（MIG1源）在F. fujikuroi中最有效，通过Tup1-Cyc8-组蛋白去乙酰酶通路建立抑制性染色质。

研究人员将dCas9-RD4与F. fujikuroi表达框整合，建立了该菌首个功能性CRISPRi平台。以erg9为靶，部分分流FPP从麦角固醇至GA，总GA提升23.5%；以des为靶，消除GA₇，获得GA₃₊₄专产株，GA₄提升2.62倍。这表明CRISPRi不仅能增强目标产物，还可定制GA组分比例（如GA₄:GA₇）。

结论：本研究为F. fujikuroi建立了定制CRISPRi系统，通过dCas9-RD4实现高效基因敲降，为必需基因研究与GA代谢精细调控提供了通用平台，也为多核丝状真菌的合成生物学改造提供了新范式。