综述：CRISPR/Cas系统中用于疾病诊断的分裂crRNA或激活子策略的最新进展

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Recent advances in split crRNA or activator strategy for disease diagnosis in CRISPR/Cas systems

　　

林电宇|秦璐璐|刘天梅|于月红|唐志成|朱小蕾|张帆|赵铮|唐本忠|曾尧

南京医科大学药学院，中国江苏南京 211166

摘要

CRISPR/Cas系统在疾病诊断中展示出了显著的效果。特别是CRISPR/Cas12a系统，由于其简单的结构和非特异性的转切割活性而表现出色。最近的研究表明，具有适当切割位点的crRNA或激活剂可以诱导出与全长度对应物相当的Cas核酸酶活性。本综述主要关注结合无扩增策略、非对称系统、逻辑门和信号放大策略的疾病诊断方法。此外，我们还讨论了其他CRISPR/Cas系统及其调节Cas蛋白活性的修饰策略的进展。总体而言，这种方法的特点和挑战得到了强调。显然，切割策略具有显著的优势，包括多样化的目标可达性、增强的碱基突变识别能力、灵活的可编程性、方法兼容性以及活性可控性。鼓励未来的研究探索切割策略在其他CRISPR/Cas系统中的应用，并克服限制以推动临床转化。

引言

各种生物标志物的发现，作为特定疾病的指示物，促进了越来越有针对性的诊断测试的发展。酶联免疫吸附测定法是临床诊断领域中常用的方法，尤其适用于感染监测。该检测方法利用特定抗原和抗体之间的反应来检测生物标志物。定量检测结果通过酶促反应产生的颜色变化来表示[1]。化学发光免疫测定法用光信号代替颜色信号，从而提高了准确性和特异性[2]。然而，这些方法通常用于检测蛋白质底物。聚合酶链反应（PCR）大大促进了核酸的检测。基于PCR的逆转录-PCR（RT-PCR）将检测范围扩展到RNA，并为后续的逆转录扩增方法提供了基础。然而，单独使用时，RT-PCR在成本效益和检测时间方面存在劣势[3]。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白系统为细菌和古菌提供了对外来核酸入侵的保护屏障。如今，CRISPR/Cas系统在疾病生物标志物的检测方面取得了显著的进展，具有高选择性和敏感性，在临床诊断中展现了巨大的潜力。根据Makarova的分类，CRISPR/Cas系统可以分为两类。第一类系统的效应模块中，多个Cas蛋白对于目标结合和处理是不可或缺的。而第二类系统，包括众所周知的Cas9、Cas12a、Cas13a和Cas14，只包含一个大的crRNA结合蛋白，该蛋白具有多个结构域，功能类似于第一类的复杂效应模块[4]。由于组成更为简单，第二类系统成为了更广泛研究和应用的对象。表1简要介绍了上述Cas9、Cas12a、Cas13a和Cas14系统的工作原理和特点。

在CRISPR/Cas系统中，CRISPR RNA（crRNA）是一个关键组成部分。在免疫防御过程中，细菌和古菌将外源性原间隔序列整合到染色体的CRISPR位点中。随后，前体CRISPR RNA（pre-crRNA）分子被表达以生成crRNA[5]。一般来说，crRNA与目标配对，作为激活剂来激活Cas蛋白以切割核酸。特别是具有HNH和RuvC结构域的CRISPR/Cas9系统已成为一个应用广泛的先锋系统。该系统需要转激活crRNA（tracrRNA），它有助于pre-crRNA的处理并协助形成crRNA-DNA复合体[5]，[6]。在crRNA和tracrRNA的帮助下，Cas9可以靶向特定的dsDNA并切割它。这一过程称为顺切割。Cas9的顺切割活性促进了基因编辑过程。然而，直到后续发现了其他效应因子如Cas12和Cas13，CRISPR/Cas系统在疾病诊断中的应用才取得重大进展。CRISPR/Cas12系统（也被称为V型系统）可以分为14个亚型。其中，CRISPR/Cas12a（以前称为CRISPR/Cpf1系统）成为了研究的重点。在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA大约43个核苷酸（nt）长，由一个5′-支架（约20 nt）和一个间隔序列（约23 nt）组成[7]，[8]，[9]，它源自被Cas12a识别的pre-crRNA[10]。研究表明，即使没有Cas9中的HNH结构域，Cas12a仍然可以通过类似RuvC的结构域发挥作用[11]。值得注意的是，两种系统的核酸酶活性激活过程通常是相似的。切割过程的初始步骤通常是识别双链DNA（dsDNA）上的原间隔序列（PAM）基序。PAM被定义为位于目标位点附近的保守序列，包含有限数量的核苷酸[12]。在5′ T富集的PAM序列引导下，形成crRNA-DNA杂交R环，随后在PAM近端寻找种子区域。随后，dsDNA以高特异性被切割。之后，单链DNA（ssDNA）被无区别地切割，这被称为反切割活性。然而，缺乏PAM的ssDNA也可以激活Cas12a进行反切割[13]。研究表明，各种Cas12a变体，包括LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a和其他同源物，在靶向双链或单链核酸时都可以表达反切割活性，而Cas9中则没有这种现象[10]，[13]，[14]。与Cas12不同，Cas13具有特异性识别RNA的能力。类似于Cas12，Cas13也可以在crRNA与目标RNA结合后启动反切割[15]。Cas14已被证明可以识别和切割ssDNA或dsDNA[16]目标，并诱导ssDNA的降解。值得注意的是，它需要类似于Cas9的tracrRNA[17]。鉴于这些特点，基于CRISPR的诊断应用迅速发展[18]。无论是针对核酸还是非核酸目标，这些系统都显示出巨大的潜力[19]。通过整合侧向流动检测[20]、扩增[21]和其他技术，检测性能得到了进一步提高。然而，以往的CRISPR相关综述仅涉及全长度的crRNA和激活剂。

近年来，关于在crRNA和激活剂中引入切割位点的裂解策略的基础研究逐步进行。研究人员证实，这种方法提供了多样化的目标可达性、增强的碱基突变识别能力、灵活的可编程性、方法兼容性以及活性可控性。据我们所知，目前还缺乏对CRISPR基诊断中裂解策略的全面阐述。本综述将主要从上述两个角度讨论使用CRISPR/Cas12系统的疾病诊断（见图1）。其他Cas蛋白，如Cas9和Cas13也将被涉及。此外，综述还将描述几种调节Cas蛋白活性的修饰策略。此外，我们强调了需要解决的几个挑战，同时也在强调裂解策略在疾病诊断中的优势和潜力。

章节片段

关于裂解crRNA的研究

普遍认为，Cas9通过crRNA和tracrRNA的配对或单个引导RNA（sgRNA）的介导而被激活。2024年，Jiang等人回顾了基于裂解sgRNA的几种体内RNA传感器[22]。本质上，裂解sgRNA等同于crRNA和tracrRNA的结合。在RNA检测过程中，目标RNA可以替代crRNA与tracrRNA结合[23]，[24]，或者与crRNA-tracrRNA复合物形成三向连接（3WJ）结构[25]。此外，

利用修饰策略调节裂解策略中的Cas蛋白活性

由于CRISPR/Cas系统中的裂解策略在方法学层面显示出显著的应用潜力，因此需要探索影响CRISPR/Cas系统本身活性的因素或条件，以拓宽其应用前景。不同的切割位点、Cas同源物[27]，[28]，[53]，目标长度[34]，[40]，[73]，底物类型[32]，[54]，[57]确实会影响活性，但这些通常都是预先设定的，无法立即改变

挑战、前景和结论

随着对CRISPR/Cas系统、基因编辑、核酸检测和疾病诊断的进一步研究，这些技术变得更加容易应用。然而，CRISPR/Cas系统在临床转化方面仍面临一些挑战。传统的基于CRISPR的诊断应用通常仅限于检测特定长度的核酸片段，并且需要复杂的扩增策略。此外，临床实践中的疾病诊断通常还需要考虑

CRediT作者贡献声明

赵铮：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。张帆：资源提供。朱小蕾：资源提供。林电宇：撰写 – 原初稿，研究，概念化。曾尧：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。唐本忠：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。唐志成：可视化。于月红：研究。刘天梅：数据整理。秦璐璐：研究

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（编号：21705080）、江苏省自然科学基金（编号：BK20221304）、江苏省高等教育机构“蓝色计划”基金、江苏省大学生创新创业培训计划（编号：202310312003Z）、深圳功能聚集体材料重点实验室（ZDSYS20211021111400001）以及深圳市科学技术和创新委员会的资助