《Biotechnology Advances》：Optimizing prime editing: Advances in efficiency enhancement
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英曲 | 英英·李 | 志邵 | 庄京宇 | 齐艳华 | 杨俊如 | 刘宇 | 王静阳 | 傅学超 | 刘家莉 | 张晓宇 | 彭天桓 | 元全 | 朱丽云
国防科技大学理学院，中国长沙 410073
摘要
Prime Editing（PE）能够在不引入双链断裂或供体DNA模
英曲 | 英英·李 | 志邵 | 庄京宇 | 齐艳华 | 杨俊如 | 刘宇 | 王静阳 | 傅学超 | 刘家莉 | 张晓宇 | 彭天桓 | 元全 | 朱丽云
国防科技大学理学院，中国长沙 410073
摘要
Prime Editing（PE）能够在不引入双链断裂或供体DNA模板的情况下，精确地进行目标插入、删除以及所有可能的碱基转换。然而，其效率在不同的基因组环境中差异很大。为了解决这个问题，人们开发了多种优化策略：蛋白质工程改造了编辑器，使其具有更强的逆转录酶活性和稳定性；对pegRNA的结构进行了改进，提高了其功能完整性和抗降解能力；通过调节PE-Flap-mismatch修复（MMR）过程来保持所需的编辑效果；最后，开发了protospacer adjacent motif（PAM）优化版的Cas蛋白变体，大幅扩展了可编辑的目标位点。本文系统地总结了这些进展，阐明了结构、机制和定位方面的改进如何共同克服了根本性的瓶颈。这些发展使PE成为一种多功能且高效的精确基因组工程工具，为其在各种生物应用中的可靠使用奠定了基础。
引言
簇状规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）系统以其可编程性彻底改变了靶向DNA操作（Cong等，2013；Jinek等，2012）。化脓性链球菌的Cas9（SpCas9）利用单个引导RNA（sgRNA）及其RuvC/HNH核酸酶结构域共同引发双链断裂（DSB）（图1A）。随后发生的错误倾向性途径，主要是非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），导致不可控的插入和缺失、低效率以及脱靶风险，从而限制了精确的核苷酸校正（Davis和Maizels，2014；Lieber，2010）。这些限制促使人们通过两种互补策略进行精确基因组编辑的创新：（a）优化核心组件，例如Cas9变体和引导RNA支架（Kim等，2022；Li等，2022；Lim等，2023；Wang等，2023b）；（b）开发新机制，如碱基编辑器，它们能够通过脱氨酶活性实现多种单碱基转换（例如G-C到T-A，T-A到G-C）而无需DSB（Komor等，2016；Matsoukas，2018）。然而，碱基编辑存在编辑类型有限、严重依赖序列环境以及编辑结果不均匀的问题（图1B）。第一代Prime Editing系统（PE1）于2019年问世（Anzalone等，2019）。它由三个核心组件组成：SpCas9切割酶（nSpCas9），其HNH结构域经过突变，可实现链特异性切割；融合的野生型Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）；以及包含间隔区、支架、逆转录酶模板（RTT）和引物结合位点（PBS）模块的prime editing引导RNA（pegRNA）（图1C）。PE1通过多步骤机制进行操作：（1）nSpCas9切割非目标链，（2）PBS与被切割的链结合，引发RTT编码的编辑产物的合成，（3）编辑后的片段与未编辑的片段竞争基因组整合，整合效率取决于片段的平衡状态（图2）。这种“搜索-替换”技术能够在不引发DSB的情况下实现所有12种碱基转换和小范围插入/缺失，绕过了HDR的依赖性和碱基编辑的突变限制（McNerney等，2021）。然而，传统Prime Editing技术的效率仍然不够理想（在许多情况下低于5%）（Lin等，2020），无法满足功能基因组学和治疗的挑战。因此，优化PE的效率对于实现其在遗传疾病建模和临床治疗中的潜力至关重要。（见表1、表2、表3。）
在本文中，我们通过多层次的优化框架系统地总结了提高Prime Editing效率的最新进展。首先详细介绍了基于结构的改进措施，包括工程化的Prime Editing蛋白和稳定的pegRNA；然后阐明了通过调节PE-Flap-mismatch修复（MMR）过程的机制改进；进一步概述了扩展protospacer adjacent motif（PAM）兼容性以扩大可编辑基因组范围的方法。这些发展为在各种基础和应用研究领域中进行稳健且多功能的精确基因组工程奠定了基础。
部分摘录
PE1的工程化逆转录酶
最初，PE1的优化依赖于提高逆转录酶的活性。通过对野生型M-MLV RT进行理性突变，改善了其模板-引物结合和聚合的准确性：T306K/W313F突变稳定了RT拇指结构域与PBS的相互作用，提高了其杂交稳定性；D200N/L603W/T330P突变增强了其在生理温度下的活性，使得能够合成更长的编辑片段（长达30个核苷酸）。这些改进形成了PE2，提高了编辑效率
一级结构优化
pegRNA的一级结构包含四个功能不同的模块（从5′到3′）：20个核苷酸的间隔区（用于识别protospacer）、支架（用于Cas9结合）、RTT（用于编码所需的编辑序列）和PBS（用于启动逆转录过程）（图5）。
为了解决Prime Editing中片段平衡的问题，开发了PE3系统（Anzalone等，2019），该系统使用额外的引导RNA来切割非目标链，促进原始未编辑链的降解，并使DNA修复偏向于编辑后的序列。在PE3的pegRNA/切割引导RNA框架基础上，进一步开发了一个三层优化系统，以克服其只能高效编辑小片段（≤44个碱基对）的固有局限：
除了上述通过工程化PE系统来提高单位点编辑效率外，扩展编辑可能性还有助于提高PE工具在其后续应用中的适应性和可编辑范围。阻碍这一扩展的主要限制是大多数PE策略依赖于传统的NGG PAM，而这种PAM无法完全覆盖所有功能基因组位点。克服这一限制有助于筛选更加特定和稳定的pegRNA位点，从而间接……
PE在动物模型和人类细胞中展示了显著的潜力，既可用于疾病建模，也可用于治疗性修正（见表3）。该技术已成功用于创建Hoxd13突变小鼠，为使用该技术开发更大的疾病相关动物模型提供了关键的实际证据（Liu等，2020）。在斑马鱼中递送纯化的PE核糖核蛋白（RNP）复合物（Petri等，2022）实现了高效引入人类病原体变异株……
结论
Prime Editing已经成为一个多功能的基因组工程平台，能够实现精确和灵活的DNA修饰。在Prime Editing蛋白和pegRNA的工程化、PE-Flap-MMR过程的调控以及PAM兼容性的扩展方面取得的进展显著提高了编辑效率。除了持续提高靶向效率外，人们还非常关注新技术可能带来的脱靶风险，例如在twin-PE中检测到的0.1%的脱靶率
英曲：撰写——原始草稿、研究、数据分析、概念化、可视化。英英·李：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。志邵：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。庄京宇：可视化、方法学。齐艳华：可视化、方法学。杨俊如：研究。刘宇：研究。傅学超：研究。刘家莉：研究。张晓宇：撰写——审稿与编辑、监督。彭天桓：
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32171429）和湖南省自然科学基金（项目编号：2022JJ30672、2024JJ9218）的资助。
