由近红外-II光热可控CRISPR/Cas9纳米平台引发的放大性铁死亡和免疫调节作用，用于治疗骨肉瘤并预防术后植入物相关感染

《Biomaterials》：Amplified Ferroptosis and Immunomodulation Triggered by NIR-II Photothermal-Controllable CRISPR/Cas9 Nanoplatform to Treat Osteosarcoma and Prevent Postsurgical Implant-Associated Infections

铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡形式，通过破坏氧化应激平衡来治疗骨肉瘤。本研究开发了一种基于近红外-II光热疗法（NIR-II PTT）和CRISPR/Cas9基因编辑的热可控纳米平台BF/pHCN，通过HSP70启动子实现时空可控的基因编辑。该平台通过负载Fe(II)和pHCN（含靶向Nrf2的sgRNA），在酸性微环境中靶向递送至肿瘤细胞，经NIR-II激光触发后，42℃热应力激活HSP70启动子，诱导Cas9蛋白表达并特异性切割Nrf2基因，双重机制（铁释放+基因编辑）协同增强铁死亡效应，同时激活免疫应答并抑制术后感染。

　　

李明飞|何柳亮|王志超|王龙|潘启勇|孙鹏飞|李代峰|张驰

郑州大学第一附属医院骨科，中国郑州450052

摘要

铁死亡已被证明是一种具有免疫调节作用的有前景的治疗方法；然而，细胞内的抗氧化系统维持了氧化还原平衡，从而降低了其效果。核因子红系2相关因子2（Nrf2）被认为是调节氧化稳态的中心转录因子。在此，我们开发了一种热可控的基因组编辑纳米平台BF/pHCN。具体来说，构建了一种带有上游HSP70启动子序列的CRISPR/Cas9质粒（HSP70-Cas9-sgNrf2，命名为pHCN）。随后，将Fe(II)和pHCN共同加载到具有近红外II（NIR-II）吸收特性的有机小分子BTP中，并用DSPE-mPEG₂₀₀₀进行包覆。生成的BF/pHCN（BTP@Fe/pHCN）能够被骨肉瘤细胞内化。在42°C下，通过NIR-II激光触发的高温处理激活了HSP70启动子，精确抑制了Nrf2基因组序列，同时促进了Fe(II)的释放，最终破坏了氧化应激状态。此外，增强的铁死亡完全引发了免疫原性细胞死亡，从而重新编程了巨噬细胞，促进了树突状细胞的成熟，并激活了细胞抗肿瘤免疫。此外，BF/pHCN还对浮游细菌表现出直接的杀菌活性，并通过针对巨噬细胞的铁代谢紊乱策略有效消除了细胞内细菌，从而启动了适应性抗菌免疫。总体而言，我们的NIR-II热可控基因组编辑纳米平台BF/pHCN表现出显著的抗肿瘤特性以及强大的抗感染和免疫调节能力，为有效管理骨肉瘤和预防术后植入物相关感染提供了可行的策略。

引言

骨肉瘤（OS）是儿童和青少年中最常见和最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，给骨科临床治疗带来了重大挑战[1]。骨骼的解剖结构复杂性使得通过传统手术方法进行完全切除变得复杂，而高剂量的化疗药物往往会导致严重的全身副作用和药物耐药性[2]。因此，当前的临床治疗方法仍然不令人满意，残疾率和死亡率仍然很高[3]。近年来，免疫疗法已成为治疗各种实体瘤的有效方法；然而，OS的免疫抑制微环境和高异质性限制了其效果[4]，[5]。此外，肿瘤切除后的大量骨质流失通常需要定制的骨科植入物[6]。化疗后自身免疫力的下降以及部分开放的伤口进一步增加了植入物相关感染（IAIs）的风险[7]，[8]。因此，迫切需要开发能够有效根除OS的同时预防术后IAIs的高效治疗平台[9]，[10]。

最近，铁死亡被确定为一种新的程序性细胞死亡方式，其特征是对铁的依赖性和有毒脂质过氧化物的细胞内积累[11]，[12]。细胞代谢和氧化还原稳态的失衡可以有效地诱导肿瘤细胞中的免疫原性细胞死亡（ICD），从而产生有效的适应性细胞免疫[13]，[14]。值得注意的是，类似铁死亡的死亡方式也对浮游细菌和细胞内细菌感染有效，从而增强了适应性抗菌免疫[15]。因此，诱导铁死亡的策略被认为是治疗OS及其术后感染的潜在替代干预措施[16]，[17]。然而，局部OS微环境中普遍存在的还原剂谷胱甘肽（GSH）水平升高会抵消氧化应激并降低铁死亡的效果[18]，[19]。在这种情况下，核因子红系2相关因子2（Nrf2）通过调节抗氧化酶（如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）以及参与GSH合成的基因（如溶质载体家族7成员11（xCT））来维持氧化还原平衡[20]，[21]。在铁死亡过程中，Nrf2通过上调GPX4和xCT的表达水平来增强细胞对氧化应激的耐受性并抵抗铁死亡[22]，[23]。因此，作为上游调控因子，特异性抑制Nrf2在肿瘤内部和外部促进铁死亡具有重大潜力[24]。

簇状规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术作为一种先进的“魔剪”基因组编辑工具，提供了通过高效精确基因组重编程治疗重大疾病的前沿机会[25]，[26]。利用CRISPR-Cas9技术敲低Nrf2基因是一种可行的策略，可以抑制氧化应激能力并增强铁死亡的效果[27]。然而，通过确保在特定刺激下对CRISPR-Cas9从基因组编辑载体中的释放进行时空控制，对于减轻基因毒性至关重要[28]，[29]，[30]。热刺激诱导的表达已被证明是一种有效调节目标基因的方法；具体来说，热休克蛋白70（HSP70）启动子在热应力条件下高度激活，当温度达到 certain 阈值（41-42°C）时，会迅速启动下游基因表达[31]，[32]，[33]。这使得CRISPR-Cas9系统能够在指定的时间点或条件下优化表达。与传统的近红外I（NIR-I）光热疗法（PTT）相比，新兴的近红外II（NIR-II）PTT由于更深的组织穿透力和较低的光毒性风险而显示出更好的热可控潜力[34]，[35]。因此，使用NIR-II高温诱导的HSP70-CRISPR-Cas9系统对于特异性抑制Nrf2具有很大的前景。

在这项研究中，我们开发了一种热可控的基因组编辑纳米平台BF/pHCN，旨在消除OS肿瘤并预防术后IAIs，同时重新编程免疫抑制微环境（图1）。首先，我们构建了一种CRISPR/Cas9治疗质粒Cas9-sgNrf2，以及上游的HSP70启动子序列（HSP70-Cas9-sgNrf2，命名为pHCN）。随后，将Fe(II)加载到苯硼酸（PBA）修饰的NIR-II PTT有机纳米载体BTP中（BTP@Fe，命名为BF）；然后通过核糖与PBA基团之间的动态硼酸酯键以及电荷吸引机制将pHCN与BF结合。使用DSPE-mPEG₂₀₀₀共同组装，形成了最终的纳米平台BF/pHCN。生成的BF/pHCN通过细胞内化过程选择性地在OS细胞内积累，并在酸性微环境中释放Fe(II)。值得注意的是，在42°C的NIR-II激光照射下，热激活诱导了HSP70启动子，准确促进了Cas9蛋白表达，抑制了Nrf2基因组序列，同时促进了Fe(II)的释放，最终破坏了OS细胞内的氧化应激状态并引发了铁死亡。此外，增强的铁死亡完全引发了ICD，从而改善了极化的促炎巨噬细胞，促进了树突状细胞（DCs）的成熟，并激活了细胞抗肿瘤免疫。此外，BF/pHCN还对浮游细菌表现出直接的杀菌活性，并通过针对巨噬细胞的铁代谢紊乱策略有效消除了细胞内细菌，从而启动了适应性抗菌免疫。总体而言，这些发现验证了我们的创新NIR-II热可控基因组编辑纳米平台BF/pHCN表现出显著的抗肿瘤特性以及强大的抗感染和免疫调节能力，为有效管理OS和预防术后IAIs和复发提供了可行的策略。

部分内容

BF/pHCN的构建和表征

为了实现可控的基因编辑功能，我们设计的CRISPR/Cas9治疗质粒（HSP70-Cas9-sgNrf2，命名为pHCN）包含在HSP70启动子控制下的Cas9基因，以及一个针对Nrf2的单一引导RNA（sgRNA）序列，该序列由下游的U6启动子驱动（图1a）。首先，我们设计并合成了三种不同的sgRNA序列，以在Nrf2编码区域诱导靶向切割和修复（表s1，支持信息）。这三个sgRNA

结论

总之，我们开发了一种热可控的基因组编辑纳米平台BF/pHCN，它可以消除骨肉瘤并根除术后感染，同时重新编程免疫抑制微环境。具体来说，构建了一种CRISPR/Cas9治疗质粒Cas9-sgNrf2，以及上游的HSP70启动子序列（HSP70-Cas9-sgNrf2，命名为pHCN）。随后，将Fe(II)和pHCN加载到PBA修饰的NIR-II PTT有机纳米载体BTP中，并与DSPE-mPEG

CRediT作者贡献声明

孙鹏飞：撰写 – 原始草稿，可视化，资源准备。李代峰：撰写 – 审阅与编辑，验证，监督，软件使用，资源提供，研究调查，资金获取，数据管理，概念构思。王龙：方法学设计，研究调查，数据管理。潘启勇：验证，软件使用，研究调查。张驰：验证，监督，资金获取。何柳亮：验证，软件使用，研究调查，数据管理。王志超：资源提供，方法学设计。李明飞：

利益冲突

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

数据可用性声明

评估本文结论所需的所有数据均包含在本文和/或补充材料中。与本文相关的额外数据可以向作者请求。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

李明飞和何柳亮对这项工作做出了同等贡献。作者感谢国家自然科学基金（82572781，和82102588）、河南省临床医学科学家（HNCMS20240059）、CAST的杰出青年人才资助计划（2023QNRC001）、河南省自然科学基金（232300421050，242301420068，和252300421367）的资助，以及