微生物食品安全仍然是一个紧迫的全球性挑战，细菌病原体对公共健康和食品系统稳定性构成重大风险（Madilo等人，2024年；Unnevehr，2022年）。单核细胞增生李斯特菌是最危险的食源性病原菌之一，由于其能够在冷藏温度下繁殖并在食品加工环境中持续存在，因此属于需要控制的五大食源性病原菌之一（欧洲食品安全局和欧洲疾病预防控制中心，2023年；Tuytschaever等人，2023年；Vidovic等人，2024年）。当单核细胞增生李斯特菌进入人体时，会引起李斯特菌病，症状从恶心到脑膜炎不等（Wai等人，2020年）。单核细胞增生李斯特菌对免疫系统较弱的人、孕妇、婴儿和老年人尤其危险（欧洲食品安全局，2025年）。当卫生和流行病学标准未得到执行时，单核细胞增生李斯特菌经常存在于食品生产中并污染食品（Vidovic等人，2024年）。南非最大的食源性疾病暴发归因于单核细胞增生李斯特菌（Olanya等人，2019年），导致数百人死亡，这突显了快速、准确和可获得的诊断工具的迫切需求。尽管有现有的监管努力，但食源性病原体在供应链中的持续存在往往与监测不足、卫生习惯差以及食品处理人员缺乏意识有关。因此，敏感可靠的诊断系统对于及时检测和预防污染至关重要，有助于提高微生物安全性和公共健康保护。
大多数法规要求在即食食品中检测非常低的细胞浓度（100 CFU/g），或零容忍水平（25克中未检测到），这一点得到了美国食品药品监督管理局（FDA）、美国农业部食品安全检验服务局（FSIS）和欧盟委员会（EC）的支持（2024年11月20日的委员会法规（EU）2024/2895号，修订了关于单核细胞增生李斯特菌的法规（EC）第2073/2005号；Farber等人，2021年）。通过选择培养基上的细胞生长和分析，可以确保适当的灵敏度（Jones & D'Orazio，2013年）。所选方法的灵敏度可以显著减少细胞生长所需的时间。因此，PCR和等温扩增方法可以在反应中达到单细胞的灵敏度（Kabiraz等人，2023年；Osek等人，2022年），从而大大缩短了细胞生长所需的时间。
由于等温扩增方法的发展，食源性病原菌的分子诊断技术取得了显著进展，这些方法可以在固定温度下指数级增加目标DNA的拷贝数（Feng等人，2025年）。其中最流行的等温扩增类型是环介导等温扩增（LAMP），该方法使用四到六个引物在恒定温度下复制目标DNA，无需热循环仪，从而实现快速高效的扩增。LAMP可以在30-60分钟内达到与PCR相当的灵敏度（Nagamine等人，2002年）。对于单核细胞增生李斯特菌，已知有几种有效的LAMP系统可以检测反应中的单个细胞（Cho等人，2014年；M.-J. Tang等人，2011年）。然而，LAMP检测系统容易产生假阳性反应（Kim等人，2023年）。为了降低这些风险，可以使用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas12a（CRISPR相关的内切酶Cas12a）系统，该系统可以识别双链扩增产物（Zhou等人，2024年）。Cas12a是一种RNA引导的内切酶，可以特异性结合与短引导RNA（gRNA）互补的DNA序列并切割附近的单链DNA探针。这使得能够分子识别LAMP产物并将DNA的存在转化为可测量的信号。CRISPR/Cas12a具有双重功能：它利用引导（g）RNA-Cas12a内切酶复合物来识别LAMP扩增产物中的特定DNA目标，并通过Cas12a对单链DNA探针的内切活性提高灵敏度。报道的一种单核细胞增生李斯特菌检测系统结合了LAMP-CRISPR/Cas12a扩增和荧光检测（Lee等人，2023年）。
除了灵敏度和特异性之外，快速、非仪器化的分析结果评估能力在单核细胞增生李斯特菌检测中也是一个关键方面。在这方面，侧向流动测试（LFT）作为一种特别可靠的工具脱颖而出。LFT是一种基于纸张的检测方法，其中标记的核酸产物被捕获在硝酸纤维素条上的特定区域，产生可见的颜色变化。这允许在没有专用设备的情况下直接进行视觉检测，使其适用于快速现场诊断（Younes等人，2024年）。最初作为免疫测定技术建立的LFT，由于等温扩增方法的发展，越来越多地用于简单和快速的核酸检测（Budd等人，2023年；Lapee-e等人，2025年）。LFT检测相比使用紫外线照射的非仪器化荧光检测具有多个优势，包括有控制区、正负样本之间的清晰视觉区分、将分析结果存储在测试条中、无需紫外线光源和黑暗环境。用于单核细胞增生李斯特菌检测的LAMP-LFT测试系统基于将荧光素和生物素标签引入引物，然后通过特异性抗荧光素抗体（anti-FAM）和链霉亲和素在扩增产物中识别它们（Ledlod等人，2020年；Srisawat等人，2022年；Wachiralurpan等人，2017年）。在这些系统中，测试区的信号强度直接与样本中存在的扩增产物数量相关。然而，LAMP-LFT的灵敏度通常低于使用仪器荧光检测的方法，如SYBR GREEN染色。这种矛盾是由于LAMP扩增产物的异质性造成的，它们由包含重复目标序列的不同长度的扩增产物混合而成。较短的标记扩增产物比长的扩增产物更有利于LFT检测（Safenkova, Kamionskaya, Zherdev, & Dzantiev，2025年）。将LFT检测与LAMP-CRISPR/Cas12a系统结合可以克服传统LAMP-LFT的局限性，因为CRISPR/Cas能够识别短和长扩增产物中的DNA目标。然而，据我们所知，之前尚未有报道用于单核细胞增生李斯特菌检测的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT测试系统。
缺乏用于单核细胞增生李斯特菌检测的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT系统可能与传统单链DNA探针的局限性有关，这种探针被激活的Cas12a切割后通过LFT检测（Chen等人，2018年）。关键问题是检测依赖于非切割探针在第一个结合区的完全结合，从而阻止金纳米颗粒结合物迁移到第二个结合区。然而，存在一些结合物可能绕过第一个结合区并在第二个结合区结合，导致假阳性结果。因此，切割探针对于在测试区形成复合体并不是必需的。因此，这种分析方案削弱了LFT作为无仪器检测方法的可靠性。几项研究提出了替代传统单链DNA探针的方案，以克服这些局限性（Ivanov, Safenkova, Zherdev, & Dzantiev，2022年；Safenkova, Kamionskaya, Ivanov等人，2025年；Y. Tang等人，2022年；Zuo等人，2025年）。基于这些研究，我们选择了一种在5′端带有三个FAM标签、3′端带有生物素标签的叉形单链DNA（15dT）探针（三脚架探针）（Safenkova, Kamionskaya, Ivanov等人，2025年）。在探针被激活的Cas12a切割并与未切割探针分离后，带有三个FAM标签的切割部分在LFT的夹心格式中容易被检测到（荧光素特异性抗体既固定在测试区也固定在金纳米颗粒表面）。因此，带有三个标签的切割部分是测试区形成可检测复合体的不可或缺的组成部分，确保信号强度与目标DNA浓度之间的直接相关性。
在这项研究中，我们开发了一种基于LAMP、CRISPR/Cas12a、叉形探针和LFT的无设备生物传感器，用于高度敏感和特异性地检测单核细胞增生李斯特菌（示意图见图1）。分析包括几个步骤：样品制备、DNA目标（hlyA基因）的LAMP扩增、CRISPR/Cas12a识别扩增产物中的双链DNA目标并切割叉形探针、磁分离以去除未切割的探针，以及LFT检测切割后的叉形探针。在样本中存在单核细胞增生李斯特菌的情况下，测试区和控制区都会出现在测试条上；相反，在没有单核细胞增生李斯特菌的情况下，只有控制区可见。据我们所知，这是首次报道使用LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT进行快速、无仪器检测单核细胞增生李斯特菌。此外，这项研究的发现首次使得可以使用同一组LAMP引物比较LAMP-LFT和LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT的效力。开发的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT检测方法已在牛奶样本上成功测试。
