热预处理可以保护牡蛎的鳃免受后续致命的热应激：基于Crassostrea angulata的组织病理学和细胞凋亡证据

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Heat priming protects oyster gills from subsequent lethal heat stress: Histopathology and apoptosis evidence in Crassostrea angulata

　　陈文心|韩子强|徐庆祥|何一坤|范武桑|李彤|阙华勇
中国厦门集美大学渔业学院海水养殖育种国家重点实验室，邮编361021

**摘要**
获得的热耐受性（热预处理）使生物能够在先前经历亚致死性热应激后承受致命的热应激。尽管在双壳类动物中通过生存分析证实了这一现象，但其主要环境接口——鳃部的组织学机制仍不清楚。本研究使用四个实验组研究了热预处理对Crassostrea angulata鳃部的影响：对照组、亚致死组、预处理组（亚致死+致死）和致死组。在不同温度条件下分析了组织病理学（HE染色和SEM）和细胞凋亡（TUNEL）。致死性应激导致鳃部收缩超过20%（与对照组相比），黏液细胞数量增加，而SEM显示纤毛断裂和纤毛丢失加剧。预处理显著减少了纤毛收缩并减轻了结构损伤。TUNEL阳性细胞密度在致死组中达到峰值，比预处理组高出8倍，而预处理组和亚致死组则表现出相似的水平。这些发现表明，热预处理在随后的致死性应激中协同缓解了机械损伤（鳃部收缩/纤毛破坏）和TUNEL检测到的细胞死亡信号。本研究为理解牡蛎的获得性热耐受性奠定了组织学基础。

**1. 引言**
近年来，受全球气候变化的影响，炎热的夏季天气频繁发生。过去一个世纪，全球平均表面温度上升了1℃。到本世纪末，温度可能再上升超过2℃（Brown和Caldeira，2017；Meinshausen等，2009）。海水温度的持续上升和极端温度波动对变温海洋生物构成了巨大风险，尤其是在低纬度的潮间带（Pinsky等，2019；Sasaki等，2022）。海洋潮间带的日温差可能超过20℃（Brahim和Marshall，2020；Legrand等，2018），最高可达47.6℃（Heo等，2023）。为了应对热应激，生物在长期进化过程中发展出了一系列适应机制。其中，基本的热耐受性是生物对一定程度热应激的先天耐受性，而获得性热耐受性则是它们“记住”先前应激经历的能力，在再次暴露于相同或更高温度应激时表现出更强的耐受性（Charng等，2023；Liu等，2019；Montagnani等，2024）。对于被迫经历温度波动的生物来说，获得性热耐受性尤为重要。

获得性热耐受性，也称为诱导热耐受性或热硬化，在多种双壳类动物中得到了证实，如Crassostrea gigas（Clegg等，1998）、C. virginica（Jackson等，2011）、Ostrea lurida（Bible等，2020）、Argopecten irradians irradians（Brun等，2009）、Perna canaliculus（Dunphy等，2018）和Ruditapes philippinarum（Tucci等，2025；Zhang等，2025）。值得注意的是，不同物种在先前热暴露后对热应激的记忆保留时间各不相同，从几天到最长记录的40天不等（Song等，2024）。获得性热耐受性的差异不仅存在于不同物种之间，也存在于同一物种的不同地理种群之间（Bible等，2020；Vinagre等，2018；Zhang等，2021），以及不同全同胞家族之间，表现出中等到低的遗传性水平（Han等，2025）。尽管在理解双壳类动物的获得性热耐受性方面取得了显著进展，但这些研究主要集中在存活率、行为测定、不同处理下的抗氧化酶活性以及少数热休克蛋白的表达模式上，而不同器官系统的组织特异性影响仍大部分未被探索。

在双壳类动物中，鳃部和消化腺对温度变化反应迅速（Zhang等，2012a；Zhang和Zhang，2012b）。与消化腺相比，鳃部具有更多功能。除了促进气体和离子交换外，鳃部还是一个过滤摄食器官，用于收集悬浮物质。作为由鳃丝和纤毛组成的主要暴露器官，它们极易受到环境应激的影响，并作为化学变化的早期传感器（Way等，1989）。此外，鳃部易于与内脏分离，因此被广泛用于研究双壳类动物的环境应激反应。例如，一周的热暴露导致C. virginica鳃部出现显著的组织病理学变化，表现为黏液细胞增殖增加和TUNEL检测到的细胞凋亡密度升高（Rahman和Rahman，2021）。关于贝类鳃丝在热应激下的组织学变化的研究相对较少，但有关盐度应激的研究揭示了双壳类鳃部对环境应激的形态变化。高盐度应激导致Sinonovacula constricta的鳃丝宽度、长度和厚度随时间逐渐减小（Cao等，2022）。同样，C. hongkongensis在渗透压应激下表现出不同的鳃丝反应：在低盐条件下扩张，在高盐环境中收缩，同时伴随细胞增殖和凋亡增加（Yue等，2024）。此外，热应激后鳃组织中的HSPs表达水平显著升高，再次表明鳃部在双壳类动物的热应激反应中起重要作用（Clegg等，1998；Song等，2024）。由于亚致死性鳃损伤会在死亡前降低摄食效率和气体交换效率，因此鳃部组织学/超微结构为分子反应与整个生物体的表现提供了直接的机制联系。鉴于双壳类动物中热预处理能增强后续热抵抗力的现象，这种预处理在鳃组织中的具体表现仍不清楚。

福建牡蛎（C. angulata），也称为葡萄牙牡蛎，是全球最常养殖的双壳类物种之一，尤其是在亚洲（Van Vu等，2025；Wang等，2010）。它具有生长速度快、产量高和营养丰富的优点，年产量超过200万吨，在中国的海水养殖业中发挥着重要作用。与其他潮间带生物不同，牡蛎由于其固着生活特性无法逃避生物或非生物应激。牡蛎进化出了强大的适应机制以承受高压环境。因此，选择C. angulata作为本研究的对象。通过设置有无热预处理的不同处理方法，观察了牡蛎在热刺激后的鳃部变化，以研究热预处理对鳃组织的影响。研究结果可以为双壳类动物的获得性热耐受性提供组织学证据，并为理解双壳类动物对环境应激的适应机制提供重要基础。

**2. 方法和材料**
**2.1. 动物**
2024年10月，从厦门的同安牡蛎批发市场收集了360多只一岁的C. angulata，壳长范围为72.33±1.09毫米。将它们置于实验室中，用20℃和26 psu的充气海水饲养6天。在适应和实验期间，每天更新水箱中50%的海水。每天喂食两次小球藻，确保在大约2小时内完全消耗。然而，在加热实验期间没有喂食。在此期间没有观察到牡蛎释放精子和卵的现象。

**2.2. 实验设计**
根据先前的研究，对于一小时的热暴露，福建牡蛎的最大非致死温度和最小致死温度分别为40℃和44℃。最佳恢复条件是20℃下饲养3天（Song等，2024）。基于这一发现，将牡蛎在不同温度和时间内进行热处理，即对照组（组C，20℃）、亚致死组（组S，20℃ → 40℃（1小时）→ 20℃）、热预处理组（组SL，20℃ → 40℃（1小时）→ 20℃（3天）→ 44℃（1小时）→ 20℃）和致死组（组L，20℃ → 44℃（1小时）→ 20℃）（图2a）。实验期间，海水盐度范围为26至27。采样时间点设定在致死温度刺激后的4小时、24小时、48小时、72小时和144小时（图2a），基于先前确定的不同预处理温度、恢复温度和恢复持续时间下的C. angulata存活率，以及每个时间点的热休克蛋白基因表达模式（Song等，2024）。每个组设置三个生物学重复组，每个重复组共30只牡蛎。每个时间点从三个重复组中随机收集2个样本，每个处理组共6个样本用于后续分析。鳃组织样本从鳃丝的中部区域采集。除了用于采样的牡蛎外，每个重复组还放置15只牡蛎用于记录存活情况。判断牡蛎死亡的标准是：牡蛎的壳完全打开，并且触碰时壳没有闭合反应。

本研究中采用40℃+热处理的理由有三个：首先，鉴于牡蛎既在淹没式养殖系统中也在潮间带养殖，需要注意的是，虽然淹没式养殖环境的温度范围在40℃至44℃之间，但在潮间带养殖区域温度始终超过40℃（Cheney等，2000；Heo等，2023；Przeslawski等，2005）。其次，使用淹没式养殖种群样本需要这种方案来避免海洋养殖环境中固有的环境温度波动（通常在25至32℃之间）的干扰。第三，短期实验设计通过自动化温度调节系统确保精确的温度维持（±0.5℃偏差），从而保证处理的准确性。

**2.3. 鳃部的组织学观察**
从每只牡蛎中取出2毫米×2毫米的鳃组织，在室温下用4%的甲醛溶液固定6小时，然后依次浸入70%、80%、90%的酒精1小时和100%的酒精I、100%的酒精II 30分钟，进行梯度脱水；在二甲苯-酒精混合溶液中透明化1小时，二甲苯I 30分钟，二甲苯II 30分钟；包埋在石蜡I中1小时和石蜡II中1小时；使用切片机制成4微米厚的组织切片。脱蜡和复水后，用苏木精染色6分钟，然后用去离子水冲洗以去除未结合的苏木精；在1%盐酸中分化10秒，然后用自来水冲洗以清除酸残留物并诱导蓝色。然后将切片浸入梯度乙醇中，并用伊红复染1分钟，清洗后用中性树胶封片。使用Nikon ECLIPSE Ci-L生物显微镜观察切片。

为了更好地了解不同温度处理下鳃丝的结构变化，使用Nikon ECLIPSE Ci-L生物显微镜的相机应用程序测量了牡蛎常见鳃丝的宽度和间距。在最大横向宽度处测量丝宽，而丝间距则通过测量相邻丝之间的最短距离来确定。每个样本选择3个切片进行HE染色/SEM/TUNEL分析，每个切片的3个清晰、不重叠的视野用于数据统计。我们在2-3个鳃丝簇上测量了所有常见鳃丝，每个组大约测量48-190次（取决于切片方向和丝的完整性）。

对于扫描电子显微镜（SEM）分析，2毫米×2毫米的鳃组织用0.1 M PBS冲洗以去除黏液和杂质，在室温下用预冷的电子显微镜固定剂固定2小时，并储存在4℃。脱水、干燥和喷金后，用显微镜观察样本。

**2.4. 鳃组织中细胞凋亡的检测**
组织切片在37℃下用蛋白酶K工作溶液（20 μg/mL）孵育25分钟后脱蜡和复水，然后用0.1 M PBS（pH 7.4）冲洗三次。细胞在室温下用0.1% Triton X-100孵育25分钟，然后用PBS冲洗。接着在室温下用平衡缓冲液孵育10分钟，然后将反应溶液与组织切片在37℃下孵育2小时，使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC）。平衡缓冲液包含10 mM Tris-HCl和1 mM Mg2?，无需稀释。之后，用DAPI对细胞进行核染色8分钟，然后用PBS冲洗3次。每次处理5分钟后，滴加抗荧光淬灭封闭剂以封闭样品，5分钟后使用Zeiss荧光显微镜观察细胞。利用Image J软件统计荧光图像中的凋亡细胞数量，并计算该区域组织的面积，进而计算凋亡细胞密度。所有图像在分析前均进行盲处理以避免观察者偏差。图像随机编码，在量化目标参数（如鳃丝的宽度和间距、荧光强度）时，分析者不知道样品组别。分析后解码编码，将数据分配到相应的组别。

2.5 统计分析
首先在每个牡蛎内部对鳃丝水平测量值进行平均，得到牡蛎级别的平均值，所有统计分析均使用这些平均值进行。使用SPSS统计软件v26进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）比较各组之间的差异，随后使用Duncan多重比较法。由于L组在72小时和144小时的生物重复次数少于3次，因此这些时间点被排除在多重比较测试之外；相反，使用独立样本t检验比较S组和SL组。数据以平均值±标准差的形式呈现。当p<0.05时，认为存在统计学上的显著差异。

3. 结果
3.1 生存率
在同时给予亚致死温度（40℃）刺激后，每天记录各组牡蛎的生存率（图1）。L组的生存率显著低于SL组和其他组（p<0.05）。到第10天时，SL组中存活的牡蛎数量显著少于C组和S组（p<0.05）。然而，在整个实验期间，S组和C组之间的生存率没有显著差异（p>0.05）。

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图1. 不同组别C. angulata在亚致死热刺激后的生存曲线。(C) 对照组（20℃）；(S) 亚致死热组（40℃处理1小时）；(SL) 热预处理组（40℃处理1小时+20℃处理3天+44℃处理1小时）；(L) 致死热组（44℃处理1小时）。第0天对S组和SL组进行40℃的热刺激，第3天对SL组和L组进行44℃的热刺激。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。p<0.05被认为具有统计学意义。*表示每个时间点各组之间存在显著差异。图例显示了热处理的时间和温度差异。

3.2 HE染色
捕获牡蛎鳃的横截面图像以研究不同热应激下的组织学变化（图2d）。在C组中，鳃丝排列紧密。鳃丝簇顶部的3-5根共同鳃丝呈现泪滴形横截面轮廓（即向外扩展并向内逐渐变细），并且相对饱满（图2b）。尽管两侧的共同鳃丝不如顶部的宽和圆，但仍然饱满，并显示出椭圆形横截面轮廓。与对照组（C组）相比，S组和C组之间的鳃丝横截面结构没有明显差异，尽管随着时间的推移发生了微妙的变化。同样，在SL组中，顶端鳃丝保持泪滴形形态，外部较宽内部较窄，尽管在24小时后两侧鳃丝略微收缩成矩形。然而，在L组中，每个鳃丝簇的共同鳃丝收缩更为严重。鳃丝的形态变得更细，显示出细长的棒状横截面轮廓（图2c）。同时，溶血腔的扩张导致鳃丝簇变宽，鳃丝簇间隙增大，黏液细胞增多。但由于大量细胞聚集，特别是在L组中，无法量化黏液细胞。

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图2. (a) 采样时间示意图。(b) 健康类型的鳃丝呈泪滴形。(c) 热应激后，鳃丝收缩成棒状。(d) 不同处理组C. angulata鳃横截面的HE染色观察。(C) 对照组（20℃）；(S) 亚致死热组（40℃处理1小时）；(SL) 热预处理组（40℃处理1小时+20℃处理3天+44℃处理1小时）；(L) 致死热组（44℃处理1小时）。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。p<0.05被认为具有统计学意义。*表示每个时间点各组之间存在显著差异。图例显示了热处理的时间和温度差异。

3.2. HE染色
捕获牡蛎鳃的横截面图像以研究不同热应激下的组织学变化（图2d）。在C组中，鳃丝排列紧密。鳃丝簇顶部的3-5根共同鳃丝呈现泪滴形横截面轮廓（即向外扩展并向内逐渐变细），并且相对饱满（图2b）。尽管两侧的共同鳃丝不如顶部的宽和圆，但仍然饱满，并显示出椭圆形横截面轮廓。与对照组（C组）相比，S组和C组之间的鳃丝横截面结构没有明显差异，尽管随着时间的推移发生了微妙的变化。同样，在SL组中，顶端鳃丝保持泪滴形形态，外部较宽内部较窄，尽管在24小时后两侧鳃丝略微收缩成矩形。然而，在L组中，每个鳃丝簇的共同鳃丝收缩更为严重。鳃丝的形态变得更细，显示出细长的棒状横截面轮廓（图2c）。同时，溶血腔的扩张导致鳃丝簇变宽，鳃丝簇间隙增大，黏液细胞增多。然而，由于大量细胞聚集，特别是在L组中，无法量化黏液细胞。

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图2. (a) 采样时间示意图。(b) 健康类型的鳃丝呈泪滴形。(c) 热应激后，鳃丝收缩成棒状。(d) 不同处理组C. angulata鳃横截面的HE染色观察。(C) 对照组（20℃）；(S) 亚致死热组（40℃处理1小时）；(SL) 热预处理组（40℃处理1小时+20℃处理3天+44℃处理1小时）；(L) 致死热组（44℃处理1小时）。O，普通鳃丝；P，主要鳃丝；M，黏液细胞；HC，溶血淋巴腔。比例尺=50 μm。(e) 鳃丝宽度箱形图。(f) 鳃丝间距箱形图。
通过量化鳃丝宽度（图2e）和鳃丝间距（图2f），进一步比较了不同热应激条件对牡蛎鳃的影响。发现同一时间点，C组和S组之间没有显著差异（p>0.05）（表1）。此外，在所有采样时间点，S组的鳃丝宽度与SL组没有显著差异（p>0.05），但显著大于L组（p<0.05）。由于生物重复次数有限（N<3），72小时和144小时的L组无法纳入多重比较测试；然而，相应的值始终低于同一时间点S组和SL组的平均值。

表1. 热刺激后鳃丝的宽度。
时间（小时）鳃丝宽度（微米）
C组 S组 SL组
43 5.74±4.86 A (N=6, n=106)
36.84±3.39 Aa (N=6, n=162)
33.21±2.32 Aa (N=6, n=121)
26.71±2.46 Ba (N=6, n=154)
24 32.65±3.21 Aab (N=6, n=123)
30.64±1.97 Aa (N=6, n=170)
23.97±3.16 Ba (N=6, n=151)
48 35.32±4.04 Aab (N=6, n=138)
30.00±3.82 ABa (N=6, n=151)
27.04±5.59 Ba (N=6, n=131)
72 32.75±3.00 Aab (N=6, n=143)
30.43±5.77 Aa (N=6, n=159)
27.59±3.68 (N=2, n=90)
144 31.88±4.56 Ab (N=6, n=143)
28.68±3.66 Aa (N=6, n=141)
23.27 (N=1, n=51)
注：不同的大写字母表示同一时间点不同处理组之间存在显著差异；不同的小写字母表示同一组内不同时间点之间存在显著差异（p<0.05）。n表示测量次数。N表示牡蛎的数量（生物重复次数），而n表示鳃丝级别的测量次数。由于生物重复次数有限，72小时和144小时的L组无法纳入多重比较测试；因此，仅描述性地呈现这些数据（未分配显著性字母）。

还分析了鳃丝间距（表2），发现L组在所有时间点的鳃丝间距最大（p<0.05）。此外，在其他采样时间点，SL组和S组之间的鳃丝间距没有显著差异（p>0.05），除了在24小时和48小时，SL组的间距显著大于S组，但显著小于L组（p<0.05）。尽管由于生物重复次数有限，72小时和144小时的L组无法纳入多重比较测试，但其相应的值始终低于同一时间点S组和SL组的平均值。

表2. 热刺激后鳃丝的间距。
时间（小时）鳃丝间距（微米）
C组 S组 SL组
49.85±1.89 AB (N=6, n=110)
8.30±2.10 Ba (N=6, n=170)
7.46±1.69 Bab (N=6, n=128)
12.35±4.03 Aa (N=6, n=155)
24 5.84±1.27 Cbc (N=6, n=120)
9.74±2.71 Ba (N=6, n=185)
12.96±2.75 Aa (N=6, n=124)
48 4.38±0.68 Cb (N=6, n=146)
7.04±1.01 Bab (N=6, n=190)
12.84±3.31 Aa (N=6, n=162)
72 6.60±1.54 Aab (N=6, n=146)
6.44±1.45 Ab (N=6, n=158)
8.48±0.32 (N=2, n=98)
144 6.36±1.88 Aab (N=6, n=149)
5.80±0.89 Ab (N=6, n=134)
10.04 (N=1, n=48)
注：不同的大写字母表示同一时间点不同处理组之间存在显著差异；不同的小写字母表示同一组内不同时间点之间存在显著差异（p<0.05）。n表示牡蛎的数量（生物重复次数），而n表示鳃丝级别的测量次数。由于生物重复次数有限，72小时（N=2）和144小时（N=1）的L组被排除在多重比较测试之外，仅描述性地呈现（未分配显著性字母）。

3.3. 扫描电子显微镜（SEM）观察
通过扫描电子显微镜（SEM）观察鳃的外表面，以探讨热应激下纤毛、侧纤毛和其他部分的反应机制（图3）。在对照组中，纤毛排列紧密，鳃丝簇之间的间隙最小。在44℃的致死热刺激后，L组在24小时、48小时和72小时（N=2）显示出严重的鳃丝损伤和广泛的纤毛脱落。在144小时（N=1）时，鳃丝收缩，鳃丝簇的间隙扩大。相比之下，在SL组中，每个时间点鳃丝表面也有一些损伤现象。然而，纤毛分布密集，鳃丝簇之间的间隙没有扩大。此外，S组中的纤毛在4小时时卷曲，这在其他组中没有观察到。

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图3. 不同处理组C. angulata鳃外表面的扫描电子显微镜（SEM）观察。（C）对照组（20℃）；(S) 亚致死热组（40℃处理1小时）；(SL) 热预处理组（40℃处理1小时+20℃处理3天+44℃处理1小时）；(L) 致死热组（44℃处理1小时）。FC，前纤毛；LC，侧纤毛；NCEC，非纤毛上皮细胞；SC，小腔；d，损伤区域；n，坏死区域。比例尺=50 μm。

3.4. TUNEL
使用TUNEL方法对切片进行免疫荧光染色分析，发现L组在每个时间点的细胞凋亡率最高（图4a）。凋亡细胞的密度先增加后随时间减少。在4小时时，L组与其他组之间的凋亡密度没有显著差异（p>0.05）。在24小时时，L组的凋亡细胞密度显著高于S组和C组（p<0.05）。到48小时时，L组的凋亡细胞密度达到峰值，显著高于所有其他组（p<0.05），随后在72小时逐渐减少（图4a和b）。统计结果显示，SL组从开始到结束与S组和C组的凋亡没有显著差异（p>0.05），但明显低于L组（图4b）。L组的凋亡细胞密度不仅在48小时显著高于SL组，而且在24小时和72小时也有所增加（N=2），分别达到SL组的2.67倍和1.91倍。

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图4. 不同处理组C. angulata鳃的免疫荧光染色分析（TUNEL方法，a）和细胞凋亡（b）（不同时间点）。（C）对照组（20℃）；(S) 亚致死热组（40℃处理1小时）；(SL) 热预处理组（40℃处理1小时+20℃处理3天+44℃处理1小时）；(L) 致死热组（44℃处理1小时）。比例尺=50 μm。*表示每个时间点各组之间存在显著差异（p<0.05）。由于生物重复次数有限，72小时（N=2）和144小时（N=1）的L组被排除在多重比较测试之外，仅描述性地呈现。

4. 讨论
已通过生存率统计和对特定基因及抗氧化酶的研究，在各种双壳类和其他海洋物种中证实了获得性耐热性，这是生物体应对重复热刺激的关键适应机制（Brun等人，2009年；Clegg等人，1998年；Tucci等人，2025年；Zhang等人，2012a年；Zhang和Zhang，2012b年）。然而，在此过程中，鳃组织（双壳类应对环境变化的关键器官）的组织学变化尚未得到充分研究，从而阻碍了从组织学层面全面理解获得性耐热性。本研究采用了苏木精-伊红染色（HE）、扫描电子显微镜（SEM）和末端脱氧核苷酸（dT）转移酶dUTP末端标记（TUNEL）测定法，并结合HE染色和凋亡结果的量化，全面评估了牡蛎鳃在热应激记忆期间的组织学变化。研究结果表明，热预处理不仅显著提高了牡蛎在随后致死热刺激下的生存率，还显著减少了鳃组织损伤，为双壳类的获得性耐热性提供了新的证据，并在分子反应和整个生物体的表现之间建立了直接的机制联系。

值得注意的是，当前实验设计的一个局限性是缺乏无恢复的预处理处理，这阻碍了直接区分预处理的即时效应和恢复依赖的修复效应。因此，这里描述的热预处理的保护效应应解释为亚致死暴露后恢复的综合结果。通过观察在不同预处理温度、恢复温度和恢复时间下，C. angulata鳃组织中热休克蛋白基因（例如Hsp10）的存活率和表达模式，我们之前的研究表明，仅进行非致命性预处理刺激而不进行恢复阶段时，后续致命热应激下的存活率并没有提高。此外，不同的恢复时间显著影响增强效果（Song等人，2024年）。因此，可以确认恢复阶段对牡蛎获得热耐受性的发展具有关键影响，并且是一个不可或缺的组成部分。鉴于恢复过程中的内在修复机制也是由之前的热预处理触发的，这项研究的核心结论并未受到质疑。尽管如此，未来包含非恢复预处理组的研究将有助于明确区分与恢复无关和与恢复相关的保护机制。

4.1. 牡蛎在热应激下的鳃组织学
基于对鳃丝横截面的观察，结合形态描述和鳃丝宽度及间距的定量测量，可以明显看出热预处理有效减轻了后续致命热刺激期间的鳃丝收缩。这使得鳃能够保持接近自然的形态。这种形态上的保持可能有助于提高牡蛎在致命热应激下的存活率，因为完整的鳃结构有助于维持不受阻碍的呼吸和摄食功能。相反，暴露于致命热应激下的牡蛎表现出严重的鳃丝收缩，这可能会阻碍生理过程，并与更高的死亡率相关。关于鳃丝收缩的病因，基于TUNEL的DNA片段化信号表明其与鳃丝形态可能存在关联，但这种模式应被视为相关性而非因果关系。

鳃丝的收缩以及黏液细胞数量和黏液分泌的增加不仅是双壳类动物在热应激下的常见反应（Rahman, Rahman, 2021），而且也发生在它们适应高盐度（Cao等人，2022；Yue等人，2024）和重金属应激（Gregory等人，1999；Valdez Domingos等人，2007）的过程中。然而，与这些双壳类动物的反应不同，硬骨鱼类在热应激下表现出不同的鳃部变化。例如，日本比目鱼和中国长吻鲶鱼表现出明显的变形、肿胀、充血和上皮细胞融合（Yan等人，2022；Zhao等人，2024），而尼罗罗非鱼的鳃组织在初级和次级鳃丝中都显示出毛细血管扩张（Esam等人，2022）。这种差异可能源于双壳类动物和硬骨鱼类在鳃结构和细胞组成上的根本差异。

4.2. 通过扫描电子显微镜对鳃丝的细微观察
同时，对鳃丝表面的扫描电子显微镜分析也揭示了类似的模式。这进一步支持了热预处理有效减轻了后续致命热刺激期间鳃丝损伤和纤毛脱落的现象，使样本表现出比热致死组更强的存活能力。值得注意的是，在亚致死刺激后4小时，扫描电子显微镜结果观察到鳃丝上的纤毛出现了卷曲现象。这种现象在其他时间和组别中并未观察到。然而，纤毛的变化过于微妙，无法通过HE染色观察到，在基于TUNEL的细胞死亡评估结果中也没有特殊情况。纤毛的卷曲可能代表了牡蛎在应激下的防御反应，反映了热预处理诱导的牡蛎热耐受性机制的调节。相比之下，致命热刺激未能触发这种防御反应，表现为纤毛脱落，最终导致牡蛎的大规模死亡。目前关于鳃丝形态变化的原因及其功能影响的研究仍然不足，需要进一步探讨。

在致命热应激组中观察到的广泛纤毛脱落并不令人意外。纤毛的9+2微管结构是纤毛活动的基础（Linck, 1973）。研究发现，当扇贝Aequipecten irradians暴露在45℃的极端温度下时，其纤毛上的超过80%的微管会溶解（Stephens等人，1989）。先前的研究发现HSP40、HSP70和HSP90与纤毛中微管的稳定性有关（Silflow等人，2011；Williams和Nelsen，1997）。在我们的先前研究中，确认Hsp70和Hsp90基因以及另外两种热休克蛋白基因（Hsp10和Hsp27）在热预处理后几小时内显著上调（Song等人，2024）。此外，这些蛋白质在其他双壳类动物对热耐受性的相关研究中也被一致记录为在亚致死热刺激后表达增加（Aleng等人，2015；Brun等人，2009；Jackson等人，2011；Tucci等人，2025）。热休克蛋白在维持细胞稳态中起着关键作用（Becker和Craig，1994）。热预处理后这些蛋白质的表达增加可能有助于减轻后续致命热刺激期间的鳃损伤。然而，本研究中并未直接测量HSP反应，因此这种解释应被视为假设机制而非观察结果。获得热耐受性的具体分子机制非常复杂，需要系统性的研究。

4.3. 鳃组织的细胞凋亡
当环境温度过高时，会促进组织细胞的死亡，包括细胞凋亡。在凋亡过程中，DNA末端会产生3′-OH（羟基）末端。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以将荧光标记的脱氧核苷酸添加到DNA断裂的3′末端，从而标记细胞的DNA断裂点。然而，TUNEL检测的是DNA片段化，因此并不专门针对凋亡，因为DNA片段化也可能发生在坏死过程中；因此，本研究中TUNEL阳性信号应谨慎解释。先前研究了急性热应激（28℃和32℃）对外来贻贝（Mytilus galloprovincialis）和本地贻贝（M. californianus）血细胞的影响。研究发现，热应激显著降低了血细胞的活性和溶酶体膜的稳定性，导致DNA双链和单链断裂以及凋亡信号通路的激活（Yao和Somero，2012）。当Mytilisepta virgata暴露于热应激后，血淋巴中的ROS水平升高，导致血细胞DNA损伤增加，吞噬能力下降，免疫能力减弱，从而导致大量死亡（Hong等人，2021）。对不同处理组中牡蛎鳃组织中TUNEL阳性细胞密度的统计分析显示，热致死组的TUNEL阳性细胞密度显著高于其他组（p<0.05），而热预处理组的TUNEL阳性细胞密度始终保持较低。这表明44℃的致命温度在牡蛎鳃组织中引发了显著的细胞死亡信号，这与之前关于C. angulata致命温度阈值的发现一致，并证实了本研究中44℃热致死组存活率急剧下降的结果。值得注意的是，在缺乏直接机制证据的情况下，TUNEL阳性增加与鳃丝形态之间的任何关系都应被视为相关性而非因果关系。

此外，在72小时和144小时的扫描电子显微镜观察中，热致死组显示出完全不同的形态。在72小时时，鳃丝严重受损，而在144小时时，鳃丝仅出现轻微收缩，几乎没有表面损伤。细胞凋亡的结果进一步证明了这种差异。这可能归因于热致死组在采样过程中的较高死亡率，导致72小时时只剩下两个样本，144小时时只有一个可检测的样本。存活超过72小时的牡蛎可能是具有更强活力的个体，表现出对热刺激的更强适应性以及较少的组织损伤和凋亡。因此，它们能够适应致命的高温度。144小时时结构损伤的明显缓解和TUNEL阳性细胞密度的降低可能反映了存活者偏差和有限的统计功效，而不是鳃损伤随时间的真正恢复。

5. 结论
总之，HE染色、扫描电子显微镜和TUNEL免疫荧光染色的综合结果共同证明了预非致命热刺激对牡蛎鳃组织的保护作用，使其免受致命热刺激造成的损伤。此外，尽管HE染色和扫描电子显微镜观察显示，经过热预处理的牡蛎在后续致命热刺激期间仍表现出鳃丝结构收缩和轻微的表面损伤，但TUNEL阳性细胞密度始终显著低于直接致命热刺激组。这些发现表明，热预处理不仅减少了鳃丝的形态变形，还显著抑制了致命刺激下TUNEL检测到的细胞死亡信号。这项研究提供了双壳类动物获得热耐受性的首个鳃水平组织学证据，为阐明其分子机制奠定了基础。此外，这些发现强调了在评估生物体韧性时考虑先前环境暴露的必要性，以及在养殖过程中采用策略性预处理协议以增强对环境压力的适应能力的潜力。

**作者贡献声明**
Que Huayong：监督、资金获取。
Chen Wenxin：撰写——初稿、调查、正式分析。
Ziqiang Han：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、资金获取、概念化。
Xu Qingxiang：调查。
He Yikun：调查。
Vu Sang Van：撰写——审阅与编辑、调查。
Li Tong：调查、正式分析。