贻贝（Mytilus galloprovincialis）在接触三种不同尺寸的聚苯乙烯纳米塑料后的组织病理学分析：混杂因素的相关性

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Histopathological analysis of mussels Mytilus galloprovincialis after foodborne exposure to three sizes of polystyrene nanoplastics: Relevance of confounding factors

　　塔尼娅·拉米雷斯（Tania Ramírez）|纳戈雷·冈萨雷斯-索托（Nagore González-Soto）|塔梅尔·哈菲兹（Tamer Hafez）|玛丽莎·萨里亚·佩雷拉·德帕索斯（Marisa Sárria Pereira de Passos）|艾德·比尔巴鄂（Eider Bilbao）|阿玛亚·奥尔贝亚（Amaia Orbea）|道格拉斯·吉利兰德（Douglas Gilliland）|米格尔-安赫尔·塞拉-贝尔特兰（Miguel-ángel Serra-Beltrán）|米伦·P·卡哈拉维莱（Miren P. Cajaraville）

CBET+研究小组，巴斯克大学（UPV/EHU）科学与技术学院动物学与动物细胞生物学系，以及实验海洋生物学与生物技术研究中心，西班牙巴斯克地区

摘要

鉴于聚苯乙烯（PS）微塑料和纳米塑料在海洋环境中的广泛存在，确定它们对代表性海洋物种（如贻贝）的潜在不良影响非常重要。对于贻贝而言，食物途径的暴露比水途径的暴露更符合实际情况，但后者受到的关注较少。本研究的目的是评估不同大小的PS纳米塑料通过食物途径暴露对海洋贻贝的组织病理学影响，重点关注涉及血细胞的炎症反应，因为已有研究表明微塑料（MPs）和纳米塑料能够引发炎症反应。实验中，使用Isochrysis galbana藻类作为食物来源，将贻贝（Mytilus galloprovincialis）暴露于50纳米、200纳米和1000纳米的PS纳米塑料中，分别设置低浓度（LD，10^3纳米/毫升）和高浓度（HD，50纳米和200纳米纳米塑料为10^8纳米/毫升，1000纳米纳米塑料为10^6纳米/毫升）条件。每次暴露持续七天，每种纳米塑料进行两次独立实验（50纳米纳米塑料的实验分别为E1和E4，200纳米纳米塑料的实验分别为E2和E5，1000纳米纳米塑料的实验分别为E3和E6）。所有实验均在9月至10月期间进行（E1-E2、E3-E4和E5-E6），以尽量减少混杂因素对研究参数的影响。结果显示，贻贝消化腺中出现了血细胞浸润、纤维化以及消化管上皮萎缩和坏死等现象。在生殖腺中，这些异常的发生率普遍低于消化腺。

总体而言，广义线性混合模型（GLMM）分析表明，生殖发育阶段和寄生虫的存在是影响消化管上皮萎缩和坏死、卵细胞闭锁以及生殖腺结缔组织中血细胞浸润的重要混杂因素。因此，在所测试的名义浓度和短期暴露条件下，这些反应似乎不能作为贻贝暴露于纳米塑料的生物标志物，因为其他因素（如生殖阶段和寄生虫感染）也会影响这些反应。未来需要进一步研究那些可能比原始纳米塑料带来更大环境风险的纳米塑料。

1. 引言

塑料垃圾在海洋中的积累是一个日益严重的社会和科学问题。据估计，全球每年产生的数百万吨塑料中，已有超过3000万吨堆积在海洋中，另有超过1亿吨流入河流，这将导致塑料在未来几十年内持续泄漏到海洋中（经合组织，2022年）。海洋环境中最常见的聚合物是聚丙烯（PP）、聚乙烯（PE）、聚酯（PES）和聚苯乙烯（PS）。据估计，塑料在环境中可以持续存在数百年甚至数千年。它们通过多种物理和生物作用被降解（Kedzierski等人，2018年；Provenza等人，2022年），产生被归类为微塑料（MPs，1–1000微米）和纳米塑料（NPs，1–1000纳米）的次生塑料（Hartmann等人，2019年）。这些颗粒在组成和大小上具有异质性，这使得对其分类和标准化研究方法变得困难（Hartmann等人，2019年）。此外，由于微塑料和纳米塑料具有较高的表面积与体积比和疏水性，它们能够吸附各种污染物并将其带入细胞和生物体内（Koelmans等人，2013年；Katsumiti等人，2021年；Martínez-álvarez等人，2022年）。较大的塑料颗粒可能导致水生生物窒息、缠绕和肠道阻塞（Barboza等人，2019年），而微塑料和纳米塑料的直接和间接影响尚不明确（Provenza等人，2022年）。多项研究表明，微塑料和纳米塑料可引起氧化应激、神经毒性、遗传毒性、生殖障碍甚至死亡（De Sá等人，2018年；González-Soto等人，2019年；Sendra等人，2020年；Sendra等人，2021年；Dang等人，2022年；Zhang等人，2022年）。不同生物体在暴露于微塑料和纳米塑料后也表现出免疫毒性和炎症反应（De Sá等人，2018年；Dang等人，2022年；Yang等人，2022年；Zhang等人，2022年；Arat等人，2024年；Compa等人，2024年），包括双壳类水生生物（Sendra等人，2020年；Sendra等人，2021年；Hodkovicova等人，2022年；Arat等人，2024年；Compa等人，2024年）。

用于评估海洋环境中微塑料和纳米塑料存在及其影响的模型生物之一是地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）。这种固着性、广泛分布的滤食性双壳类生物能够在其组织中积累污染物，包括颗粒污染物。因此，它们被广泛用作生物指示物种，用于测定环境中多种传统和新兴污染物的浓度（Farrington等人，2016年），包括微塑料和纳米塑料（Bessa等人，2019年；Li等人，2019年；Provenza等人，2022年）。此外，它们还是重要的监测物种，因为它们会对多种污染物产生生物学反应（Cajaraville等人，2000年；Provenza等人，2022年；Corsi等人，2023年）。组织水平的改变可以指示可逆或不可逆的变化，这些变化可能转化为特定的疾病状态。因此，组织病理学是评估污染物影响的重要工具（Bignell等人，2012年；Zorita等人，2006年；Garmendia等人，2011年；González-Soto等人，2019年）。例如，Brate等人（2018年）报告了贻贝组织在暴露于50–570微米聚乙烯颗粒后出现的结构变化以及血细胞聚集现象。

许多研究探讨了微塑料和纳米塑料对贻贝的影响，但这些研究大多基于水途径的暴露（Von Moos等人，2012年；Avio等人，2015年；Sussarellu等人，2016年；Détrée和Gallardo-Escárate，2017年；Brate等人，2018年；Pittura等人，2018年；Von Hellfeld等人，2022年）。对于这些滤食性生物而言，食物途径的暴露可能更符合实际情况，因为双壳类生物可能会将塑料颗粒与食物（如微藻）一起摄入。然而，使用食物途径暴露方法的研究相对较少（Paul-Pont等人，2016年；Capolupo等人，2018年；Green等人，2019年；González-Soto等人，2019年），尤其是针对PS纳米塑料的研究。无论是水途径还是食物途径的研究都表明，贻贝能够摄入微塑料和纳米塑料，这些颗粒主要存在于消化道中，但根据颗粒大小的不同，部分颗粒也可能转移到血淋巴细胞、鳃和消化腺组织中（Browne等人，2008年；Von Moos等人，2012年；Avio等人，2015年；Paul-Pont等人，2016年；González-Soto等人，2019年；González-Soto等人，2022年；Von Hellfeld等人，2022年）。因此，这些颗粒会引起从分子到组织和生理层面的各种影响。颗粒大小似乎是决定其命运和影响的主要因素，较小的颗粒通常具有更高的毒性潜力（Dang等人，2022年）。然而，据我们所知，尚未有专门研究比较不同大小的纳米塑料颗粒对贻贝的组织病理学影响。

本研究的假设是，短期饮食暴露于三种不同大小的PS纳米塑料（50纳米、200纳米和1000纳米）会导致贻贝（M. galloprovincialis）消化腺和生殖腺的组织病理学改变，且高剂量和较小颗粒大小引起的改变更为明显。因此，主要目的是确定短期暴露（七天）于三种不同大小的PS纳米塑料对贻贝消化腺和生殖腺可能造成的组织病理学改变。特别关注了炎症反应，如血细胞组织浸润，作为纳米塑料污染的潜在生物监测指标。同时，还评估了生殖发育阶段和寄生虫的存在作为混杂因素，因为这些因素也已知会导致贻贝的炎症反应（Villalba等人，1997年；Garmendia等人，2011年；Bignell等人，2012年；Carella等人，2015年）。

2. 材料与方法

2.1. 贻贝的获取与适应

由于各种实验对贻贝的需求量很大，而近年来巴斯克地区河口和沿海生态系统中贻贝的供应不足，因此从Angulas Aguinaga S.A.U（西班牙伊鲁拉）获取了贻贝。2021年12月，从加利西亚的Porto do Son（北纬42o43’38.7’’，西经9o00’08.8’’）采集贻贝，并在Arousa河口（北纬42o33’40.7’’，西经8o54’09.9’’）进行养殖。2022年9月8日、16日和29日，大约750–900只贻贝分三批通过聚乙烯托盘运送到巴斯克大学（UPV/EHU）的Plentzia海洋站（PiE）。到达PiE后，选择壳长在3.5至5.5厘米之间的贻贝，并在300升的聚丙烯水箱中适应五天。适应期间，贻贝生活在从Butroi河口（巴斯克地区Plentzia，北纬43°24'47.0"N，西经2°56'52.8"W）抽取的海水中，过滤后的水粒径≤3微米。贻贝禁食两天后，每天喂食一次通过西班牙国家藻类银行（Power Aquaculture，西班牙）提供的Isochrysis galbana微藻培养物，该培养物在PiE的微藻培养室中于19°C和恒定光照（395.33勒克斯，Sylvania，德国）条件下生长，并喂食F/2藻类饲料（Fritz Pro Aquatics，内华达州Mesquite）。贻贝适应期间的水质参数为：温度20.68±0.43°C；溶解氧>80%；电导率34.34±0.23 PSU；pH值7.25±0.2。用于实验E3和E4的贻贝在适应期间产卵。

2.2. 纳米塑料的获取与表征

实验中使用的聚苯乙烯（PS）颗粒是从Polysciences Inc.（美国沃灵顿）购买的商业微球，共有三种尺寸：#08691–10（50纳米，变异系数CV为15%）、#07304–15（210纳米，CV为8%）、#07310–15（1060纳米，CV为3%），并提供等效的总颗粒重量（2.5% w/v）。PS纳米塑料的表征采用动态光散射（DLS，Zetasizer，Malvern）和Coulter Particle Size（CPS）DC24000 UHR离心机（CPS Instruments，荷兰）进行，具体方法参考González-Soto等人（2025年）的研究。DLS结果显示，标称尺寸为50纳米和200纳米的PS纳米塑料倾向于聚集，其水动力直径分别约为755纳米和1613.5纳米。标称尺寸为1000纳米的PS纳米塑料的水动力直径约为1252纳米。多分散指数（PdI）范围为50纳米PS纳米塑料的0.63到200纳米PS纳米塑料的1.0。所有研究的PS纳米塑料均表现出强烈的负表面电荷，200纳米PS纳米塑料的电荷范围为?536.00 mV，1000纳米PS纳米塑料的电荷范围为?666.00 mV。CPS结果显示，标称尺寸为50纳米的PS纳米塑料中，最主要的尺寸群体为124.53纳米；标称尺寸为200纳米的PS纳米塑料中，最主要的尺寸群体为220.34纳米；标称尺寸为1000纳米的PS纳米塑料中观察到两个主要尺寸群体，分别为437.51纳米和1017.86纳米（González-Soto等人，2025年）。

2.3. 实验设计

实验设计详见González-Soto等人（2025年）。每个纳米塑料尺寸设置三个实验组：对照组、低浓度组（LD，103纳米/毫升）和高浓度组（HD，50纳米和200纳米纳米塑料为108纳米/毫升，1000纳米纳米塑料为106纳米/毫升）。这些名义浓度基于海洋环境中实际发现的浓度（Peng等人，2020年），以及已知对贻贝属（Mytilus sp.）有毒的测试浓度（Paul-Pont等人，2016年；Sendra等人，2021年）。每周设置六个水族箱，分别进行不同的处理：两个对照组重复实验、第一个纳米塑料处理的两个重复实验以及第二个纳米塑料处理的两个重复实验。第一周，第一个纳米塑料处理为E1=50纳米PS纳米塑料，第二个处理为E2=200纳米PS纳米塑料；第二周，第一个纳米塑料处理为E3=1000纳米PS纳米塑料，第二个处理为E4=与E1相同；第三周，第一个纳米塑料处理为E5=与E2相同，第二个处理为E6=与E3相同。在同一时间进行的实验共享了对照组（图S1）。用于驯化期间喂养贻贝的同一种微藻Isochrysis galbana也被用来进行纳米颗粒（NPs）的食源性暴露实验。每天，从1升Erlenmeyer培养物中取出8份540×10^6个微藻细胞（每只贻贝2×10^7个细胞），并与所需名义浓度和类型的NPs混合24小时。根据González-Soto等人（2025年）的报告，通过扫描电子显微镜（SEM）观察了与NPs孵育24小时后的微藻图像，以观察细胞与NPs之间的相互作用。可以观察到，当微藻暴露于较小的NPs（≤200纳米）时，NPs嵌入了丰富的细胞外聚合物物质（EPS）中，因此难以区分NPs与微藻细胞之间的相互作用。而在暴露于1000纳米NPs的微藻中，则没有观察到EPS，NPs的同聚以及与藻类表面的相互作用/异聚现象很明显（González-Soto等人，2025年）。经过五天的驯化后，从9月13日开始对贻贝进行为期七天的暴露实验（E1-E2），9月21日开始E3-E4，10月4日开始E5-E6（图S1）。为此，将27只贻贝分配到30升的水族箱中（水族箱内注满过滤后的海水）。每天更换水，并将微藻或与NPs孵育过的微藻添加到贻贝水族箱中。实验期间保持室温及光照周期恒定，即12小时黑暗和12小时光照。每天在水更换后和添加微藻前检查水质参数，如电导率、溶解氧、pH值和温度。第一周（实验1&2）：温度：20.84±0.75°C，溶解氧>80%，电导率：34.28±0.19；pH值：7.39±0.26。第二周（实验3&4）：温度：20.7±0.1°C，溶解氧>80%，电导率：34.50±0.07；pH值：7.22±0.16。第三周（实验5&6）：温度：19.8±0.1°C，溶解氧>80%，电导率：33.4±0.07；pH值：6.88±0.07。

2.4. 解剖和组织学
每个实验组取10只贻贝进行消化腺和生殖腺的解剖，以提取组织样本进行组织学处理。相同的贻贝也被用于提取血淋巴并分析血细胞反应，以及确定健康指数（González-Soto等人，2025年）。消化腺和生殖腺被放入一次性塑料盒中，并浸入固定剂（4% v/v甲醛）中。24小时后，固定剂被70%乙醇（v/v）替换，样本在4°C下保存以备进一步处理。为了进行石蜡包埋，使用Leica ASP 300组织处理器通过一系列逐渐增浓的酒精处理进行脱水。脱水后，使用Leica EG 1150 H组织包埋中心将样本浸入液态石蜡中。使用塑料模具，并将样本放入之前用于固定的相同盒中。然后在室温下至少晾干一天。之后，将石蜡块放在Bio Optica PF100冷却板上几个小时，然后使用Leica RM2125 RTS切片机切成5微米的切片。获得的切片放入40°C的蒸馏水浴中膨胀，再用解剖针帮助将切片放置在预先涂有白蛋白的载玻片上以便组织粘附。组织制备物在37°C的烤箱中过夜干燥。最后，使用Leica Autostainer XL工作站（Leica ST5010）用苏木精-伊红（Gamble和Wilson，2002）进行染色，并使用Leica CV5030玻璃盖片架进行封片。

2.5. 组织病理学分析
在Olympus BX61光学显微镜下观察组织制备物，并确定不同组织病理改变和寄生虫的流行情况。在消化腺中观察到的改变包括：血细胞浸润、棕色细胞的出现、粒细胞瘤、纤维化以及消化管上皮的萎缩和坏死。在生殖腺中观察到的改变包括：血细胞浸润、棕色细胞的出现、粒细胞瘤、纤维化以及卵细胞的闭锁和坏死。寄生虫的鉴定依据Villalba等人（1993年）、Villalba等人（1997年）和Darriba Cou?ago（2017年）的方法。使用Garmendia等人（2011年）描述的公式计算流行率：流行率=NH/Ns，其中NH是显示病理或寄生虫的个体数量，NS是每个样本分析的个体数量。计算卵细胞闭锁和卵细胞坏死的流行率时仅考虑雌性个体。此外，在生殖腺的情况下，还记录了每个个体的性别、配子发生阶段和生殖腺指数，依据Seed（1969年）和Ortiz-Zarragoitia等人（2011年）的标准（表S1）。

2.6. 统计分析
使用SPSS Statistics（IBM，版本28）进行统计分析。为了确定不同对照组之间以及每个实验中对照组与暴露于不同大小和测试（名义）浓度NPs的样本之间的显著差异，对于流行率和性别比例使用了χ2检验，而对于生殖腺指数则使用了Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验发现显著差异，则进行Dunn的事后检验以比较均值对。使用具有二项误差分布的广义线性混合模型（GLMM）同时建模所有可能影响数据的相关因素。因此，将NPs的暴露类型（大小、浓度）和不同的混杂因素（性别、配子发育阶段、寄生虫的存在）作为固定因素。将重复实验（水族箱）之间的差异作为具有对角协方差结构的随机效应，以比较每个实验内的重复水族箱以及每个NPs的两个独立实验。该模型考虑了14种观察到的病理情况：消化腺和生殖腺中的血细胞浸润（在滤泡和结缔组织中）、消化上皮和消化腺结缔组织中的棕色细胞、消化腺滤泡和生殖腺结缔组织中的粒细胞瘤、消化腺和生殖腺的纤维化、消化腺的萎缩、消化腺的坏死、卵细胞的坏死和卵细胞的闭锁。所有检验的置信水平为95%（p<0.05）。

3. 结果
3.1. 消化腺组织病理学
观察到多种改变，如血细胞浸润（图1A和1C）、结缔组织（CT）和消化道（DT）中的棕色细胞（图1B）、粒细胞瘤（图1C）、纤维化（图1D和1F）、消化管上皮（DE）的萎缩（图1E）以及DE的坏死（图1F）。此外，还发现了诸如立克次体、类似衣原体的生物或RCLOs（图2A）、Marteilia sp.原生动物（图2B）、细胞内纤毛虫MPX（图2C和2D）、Steinhausia mytilovum微孢子虫（图2F）和Mytilicola intestinalis桡足类（图2E）等寄生虫。这些组织病理改变和寄生虫的流行率分别在图S2A和S2B中给出，仅针对对照组贻贝；而在图3和图4中分别给出了每个实验所有组的流行率。

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图1. (A) 暴露于50纳米HD的贻贝的结缔组织（CT）和消化道（DT）中的血细胞浸润（*）。(B) 对照组贻贝CT中的棕色细胞（箭头）。(C) 对照组贻贝雄性生殖腺滤泡内的粒细胞瘤（GR）和血细胞浸润（*）。(D) 暴露于200纳米HD的贻贝中的纤维化（FI）。(E) 暴露于50纳米LD的贻贝中消化上皮（DE）的萎缩（AT）。(F) 暴露于1000纳米LD的样本中DE的坏死（N）；CT中也可以观察到纤维化。

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图2. (A) 暴露于200纳米HD的贻贝消化上皮中的RCLO（圆圈）和Marteilia sp.（箭头）。(B) 对照组贻贝中的Marteilia sp.（箭头）。(C) 暴露于50纳米HD的贻贝消化管腔内被血细胞吞噬的细胞内纤毛虫MPX（箭头）。(D) 暴露于1000纳米LD的贻贝卵细胞中的Steinhausia mytilovum微孢子虫（箭头）。(F) 占据暴露于50纳米HD的贻贝消化道的Mytilicola intestinalis桡足类。

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图3. 对照组贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS NPs（E1和E4）、200纳米PS NPs（E2和E5）以及1000纳米PS NPs（E3和E6）七天的贻贝消化腺中组织病理改变的流行率（%）。在每个实验中，两个重复实验合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据每种病理的χ2检验组间存在显著差异（p<0.05）。CT表示结缔组织；DT表示消化道；DE表示消化管上皮。

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图4. 对照组贻贝以及暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS NPs（E1和E4）、200纳米PS NPs（E2和E5）以及1000纳米PS NPs（E3和E6）七天的贻贝消化腺中寄生虫的流行率（%）。在每个实验中，两个重复实验合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据每种寄生虫的χ2检验组间存在显著差异（p<0.05）。
在不同实验的对照组中，血细胞浸润、纤维化、DE的萎缩和DE的坏死具有最高的流行率（图S2A）。不同实验对照组之间的显著差异仅出现在DE的萎缩上（图S2A）。实验E1-E2（50%）和E3-E4（55%）的对照组中的萎缩流行率显著高于E5-E6（15%）的对照组。

为了分析不同名义浓度和大小的NPs对每个实验的影响，最高流行率出现在血细胞浸润、纤维化、DE的萎缩和DE的坏死上（图3，图4），无论是在对照组还是暴露组中。在E1中，对照组中的DE坏死流行率显著高于50纳米HD组。但在E4中未观察到这一点。在E2中，对照组中的CT棕色细胞流行率显著高于200纳米HD组（图3）。在E3中，对照组和1000纳米LD组在纤维化、DE的萎缩和坏死方面存在显著差异。1000纳米LD组的坏死（100%）和纤维化（83.33%）的流行率高于对照组（分别为75%和50%）（图3）。然而，对照组的萎缩流行率（55%）高于1000纳米LD组（5%）。同样，对照组中的DT棕色细胞流行率也显著高于1000纳米LD组（11.11%）和1000纳米HD组（0%）。

3.2. 消化腺中的寄生虫出现
在研究的生物体中观察到了多种寄生虫：RCLOs、Marteilia sp.、细胞内纤毛虫MPX、Mytilicola intestinalis和未知原生动物（图2）。在对照组中，Mytilicola intestinalis桡足类和细胞内纤毛虫MPX的流行率最高（图S2B）。此外，E3-E4组中MPX的流行率显著高于E1-E2和E5-E6组，分别为44%和5%及0%。所有对照组和暴露组的寄生虫流行率均低于50%（图4），但许多个体同时存在多种寄生虫。在六个实验中都观察到了各种寄生虫。在所有实验中，Mytilicola intestinalis桡足类的流行率最高（图4）。在E2中，200纳米HD组中RCLOs的流行率显著高于对照组；200纳米HD组的流行率为36%，而对照组中则没有这种寄生虫。在E3中，对照组中纤毛虫MPX的流行率显著高于其他组，对照组为40%，而其他组不超过50%（图4）。在E4实验中观察到了相同的现象，对照组中MPX的感染率显著高于同时暴露于50纳米PS纳米颗粒（LD和HD）的贻贝（图4）。在E5实验中，与对照组相比，200纳米HD组中Marteilia sp.的感染率显著增加。对照组中该寄生虫的感染率仅为5%，而200纳米HD组中这一比例为30%（图4）。200纳米HD组中Mytilicola intestinalis的感染率也更高，为45%，而200纳米LD组中为10.5%（图4）。在E6.3.3实验中，各组间寄生虫感染率没有显著差异。

3.3 性别比例
根据卡方检验（X2 test），在六个实验中，不同实验组之间的性别比例没有显著差异（表S2），尽管在E3实验的1000纳米LD组和1000纳米HD组中雌性个体（N=13）多于雄性个体（N=6）。在研究的贻贝中没有发现雌雄同体的个体。一些个体处于产卵后和/或休息阶段，由于缺乏可辨别的生殖腺特征而无法确定其性别（E1-E2组中各1个个体，E4组中1个个体，E5-E6组中各1个个体，E6组中3个个体）。

3.4 配子发育和生殖腺指数
由于在不同组间发现了性别间的显著差异（P<0.05），因此对雄性和雌性贻贝分别进行了分析。
在E1-E2和E5-E6的对照组中，雄性贻贝大多处于配子发育后期，生殖腺成熟，并处于产卵阶段；而在E1-E2组中少数个体处于配子发育早期，E5-E6组中部分个体处于产卵后阶段（图5A）。然而，在生殖腺指数（GI）方面没有发现显著差异（图5A）。对于雌性贻贝，大多数处于配子发育后期（E1-E2），而在E3-E4和E5-E6实验中则主要为产卵阶段（图5B）。由于存在处于产卵后阶段的个体，E3-E4组中对照组? GI（2.9）显著低于E5-E6组（4.3）（图5B）。

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图5. 不同对照组中雄性（A）和雌性（B）贻贝的生殖腺指数（GI）平均值（线条）及其标准差（条形），以及配子发育阶段（分组条形）的百分比。字母表示根据Kruskal-Wallis检验（p<0.05）发现的显著差异。
关于不同浓度和大小的纳米颗粒（NPs）暴露对不同实验中GI的影响，在E3-E4实验的雄性贻贝组间观察到了显著差异（图6），而在雌性贻贝组间未观察到显著差异（图S3）。

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图6. 不同对照组中雄性贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS纳米颗粒（E1和E4）、200纳米PS纳米颗粒（E2和E5）以及1000纳米PS纳米颗粒（E3和E6）七天的雄性贻贝的生殖腺指数（GI）平均值（线条）及其标准差（条形），以及配子发育阶段（分组条形）的百分比。每个实验中两个重复组的数据合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据Kruskal-Wallis检验（p<0.05）发现的显著差异。
在E1实验中，大多数雄性贻贝处于配子发育后期；50纳米LD组中占55%，50纳米HD组中占100%，对照组中也有40%的个体处于成熟生殖腺阶段（图6）。此外，在对照组和50纳米LD组中仅有少数个体处于产卵阶段，而在对照组和50纳米LD组中还有部分个体处于配子发育早期阶段（图6）。对于雌性贻贝，大多数也处于配子发育后期（E1-E2），而在E3-E4和E5-E6实验中则主要为产卵阶段（图5B）。由于存在处于产卵后阶段的个体，E3-E4对照组中的GI显著低于E5-E6组（图5B）。

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图5. 不同对照组中雄性（A）和雌性（B）贻贝的生殖腺指数（GI）平均值（线条）及其标准差（条形），以及配子发育阶段（分组条形）的百分比。字母表示根据Kruskal-Wallis检验（p<0.05）发现的显著差异。
关于不同浓度和大小的纳米颗粒暴露对GI的影响，在E3-E4实验的雄性贻贝组间观察到了显著差异（图6），而在雌性贻贝组间未观察到显著差异（图S3）。

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图6. 不同对照组中雄性贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS纳米颗粒（E1和E4）、200纳米PS纳米颗粒（E2和E5）以及1000纳米PS纳米颗粒（E3和E6）七天的雄性贻贝的生殖腺指数（GI）平均值（线条）及其标准差（条形），以及配子发育阶段（分组条形）的百分比。每个实验中两个重复组的数据合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据Kruskal-Wallis检验（p<0.05）发现的显著差异。
在E1实验中，大多数雄性贻贝处于配子发育后期，50纳米LD组中占55%，50纳米HD组中占100%，对照组中也有40%的个体处于成熟生殖腺阶段（图6）。此外，在对照组和50纳米LD组中仅有少数个体处于产卵阶段，而在对照组和50纳米LD组中还有部分个体处于配子发育早期阶段（图6）。对于雌性贻贝，它们大多处于早期发育阶段，尽管也有一些个体处于产卵和产卵后阶段。最常见的阶段是配子发育后期，对照组中占57%，50纳米LD组中占57%，50纳米HD组中占44%（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异。

同样，在E2实验中，雄性贻贝中有30%到62.50%处于配子发育后期，其余37.50%到50%的个体处于成熟生殖腺阶段（图6）。雌性贻贝则处于早期和配子发育后期、成熟阶段、产卵阶段以及产卵后阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异。

在E3实验中，两种性别的贻贝的配子发育阶段分布相似。在雄性贻贝中，除了1000纳米LD组外，所有组都处于产卵阶段（图6）。对照组中有87%的个体处于产卵阶段，1000纳米HD组中有100%的个体处于产卵阶段。其他主要阶段是成熟生殖腺和产卵后阶段，1000纳米LD组中仅有少数个体处于配子发育后期（图6）。该组中大多数个体（66%）的生殖腺处于成熟状态。因此，1000纳米LD组的GI高于1000纳米HD组（图6）。对于雌性贻贝，所有实验组中大多数（58-85%）都处于产卵阶段（图S3）。此外，在对照组中还有少数个体处于成熟生殖腺和产卵后阶段，以及配子发育早期阶段（图S3）。

在E4实验中，雄性贻贝大多处于成熟和产卵阶段，仅有少量个体处于产卵后阶段（图6）。雌性贻贝也大多处于产卵阶段，其次是成熟阶段，而在暴露于50纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）和高剂量（HD）的贻贝中，分别有部分个体处于产卵后阶段和配子发育后期阶段（图S3）。

在E5实验中，雄性和雌性贻贝都主要处于成熟生殖腺阶段（图6和S3）。在雄性贻贝中，各组中成熟生殖腺阶段的百分比相似；200纳米LD组中占55%，200纳米HD组中占60%（图6）。其余个体大多处于配子发育后期，其次是产卵和产卵后阶段（图6）。对于雌性贻贝，它们主要处于成熟生殖腺阶段，200纳米HD组中占42%（图S3）。在对照组和200纳米LD组中，大多数个体处于产卵阶段，分别占62%和44%。在对照组和200纳米LD组中，仅有少数个体处于配子发育后期和产卵后阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异（p>0.05）。

同样，在E6实验中，雄性和雌性贻贝都主要处于成熟生殖腺阶段（图6和S3）。在雄性贻贝中，对照组中的贻贝处于成熟、产卵和产卵后阶段。而暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）的贻贝中，62.50%和70%的个体处于成熟阶段，暴露于1000纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝中，分别有62.50%和70%的个体处于成熟阶段，其余的雄性贻贝分别处于配子发育后期（25%）和产卵后阶段（20%）（图6）。对于雌性贻贝，成熟阶段占主导，比例范围为37.50%到77.78%（图S3）。在对照组中，其余雌性贻贝都处于产卵阶段（62.50%），而在暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）和高剂量（HD）的贻贝中观察到配子发育后期和产卵阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异（p>0.05）。

3.5 生殖腺组织病理学
在生殖腺中观察到结缔组织（CT）和生殖腺滤泡中的血细胞浸润（图7A、7B和7D）、卵细胞闭锁（图7B）、卵细胞坏死（图7B）、纤维化以及CT和滤泡中出现棕色细胞。不同病理情况的流行率如图8和图S4所示。总体而言，结缔组织中的血细胞浸润和卵细胞闭锁的流行率最高。在寄生虫方面，仅在生殖腺中观察到微孢子虫Steinhausia mytilovum（图2E），但其流行率较低（图8和图S4）。

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图7. (A) 暴露于200纳米LD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）和卵细胞中的Steinhausia mytilovum（箭头）。(B) 暴露于1000纳米HD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）、卵细胞闭锁（AT）和坏死卵细胞（N）。(C) 暴露于50纳米HD的贻贝处于产卵阶段的雄性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）。(D) 暴露于50纳米HD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡（F）内残留的配子及结缔组织中的弥漫性血细胞浸润。

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图8. 对照组贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS纳米颗粒（E1和E4）、200纳米PS纳米颗粒（E2和E5）以及1000纳米PS纳米颗粒（E3和E6）七天的贻贝的生殖腺中组织病理学改变和微孢子虫寄生虫的流行率（%）。每个实验中两个重复组的数据合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据χ2检验（p<0.05）发现的组间显著差异。
关于不同实验中不同浓度和大小的纳米颗粒暴露对GI的影响，在E3-E4实验的雄性贻贝组间观察到了显著差异（图6），而在雌性贻贝组间未观察到显著差异（图S3）。

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图6. 不同对照组中雄性贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS纳米颗粒（E1和E4）、200纳米PS纳米颗粒（E2和E5）以及1000纳米PS纳米颗粒（E3和E6）七天的雄性贻贝的生殖腺指数（GI）平均值（线条）及其标准差（条形），以及配子发育阶段（分组条形）的百分比。每个实验中两个重复组的数据合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据Kruskal-Wallis检验（p<0.05）发现的组间显著差异。
在E1实验中，大多数雄性贻贝处于配子发育后期，50纳米LD组中占55%，50纳米HD组中占100%，对照组中也有40%的个体处于成熟生殖腺阶段（图6）。此外，在对照组和50纳米LD组中仅有少数个体处于产卵阶段，而在对照组和50纳米LD组中还有部分个体处于配子发育早期阶段（图6）。对于雌性贻贝，它们大多处于早期阶段，尽管也有一些个体处于产卵和产卵后阶段。最常见的阶段是配子发育后期，对照组中占57%，50纳米LD组中占57%，50纳米HD组中占44%（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异。

同样，在E2实验中，雄性贻贝中有30%到62.50%处于配子发育后期，其余37.50%到50%的个体处于成熟生殖腺阶段（图6）。雌性贻贝则处于早期和配子发育后期、成熟阶段、产卵阶段以及产卵后阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异。

在E3实验中，两种性别的贻贝的配子发育阶段分布相似。在雄性贻贝中，除了1000纳米LD组外，所有组都处于产卵阶段（图6）。对照组中有87%的个体处于产卵阶段，1000纳米HD组中有100%的个体处于产卵阶段。其他主要阶段是成熟生殖腺和产卵后阶段，1000纳米LD组中仅有少数个体处于配子发育后期（图6）。在该组中，大多数个体（66%）的生殖腺处于成熟状态。因此，1000纳米LD组的GI高于1000纳米HD组（图6）。对于雌性贻贝，所有实验组中大多数（58-85%）都处于产卵阶段（图S3）。此外，在对照组中还有少数个体处于成熟生殖腺和产卵后阶段，以及配子发育早期阶段（图S3）。

在E4实验中，雄性贻贝大多处于成熟和产卵阶段，仅有少量个体处于产卵后阶段（图6）。雌性贻贝也大多处于产卵阶段，其次是成熟阶段，而在暴露于50纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）和高剂量（HD）的贻贝中，分别有部分个体处于产卵后阶段和配子发育后期阶段（图S3）。

在E5实验中，雄性和雌性贻贝都主要处于成熟生殖腺阶段（图6和S3）。在雄性贻贝中，成熟生殖腺阶段的百分比在各组间相似；200纳米LD组中占55%，200纳米HD组中占60%（图6）。其余个体大多处于配子发育后期，其次是产卵和产卵后阶段（图6）。对于雌性贻贝，它们主要处于成熟生殖腺阶段，200纳米HD组中占42%（图S3）。在对照组和200纳米LD组中，大多数个体处于产卵阶段，分别占62%和44%。在对照组和200纳米LD组中，仅有少数个体处于配子发育后期和产卵后阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异（p>0.05）。

同样，在E6实验中，雄性和雌性贻贝都主要处于成熟生殖腺阶段（图6和S3）。在对照组中，贻贝处于成熟、产卵和产卵后阶段。而暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）的贻贝中，62.50%和70%的个体处于成熟阶段，暴露于1000纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝中，分别有62.50%和70%的个体处于成熟阶段，其余的雄性贻贝分别处于配子发育后期（25%）和产卵后阶段（20%）（图6）。对于雌性贻贝，成熟阶段占主导，比例范围为37.50%到77.78%（图S3）。在对照组中，其余雌性贻贝都处于产卵阶段（62.50%），而在暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）和高剂量（HD）的贻贝中观察到配子发育后期和产卵阶段（图S3）。在不同性别的各组间未发现GI的显著差异（p>0.05）。

3.5 生殖腺组织病理学
在生殖腺中观察到结缔组织（CT）和生殖腺滤泡中的血细胞浸润（图7A、7B和7D）、卵细胞闭锁（图7B）、卵细胞坏死（图7B）、纤维化以及CT和滤泡中出现棕色细胞。不同病理情况的流行率如图8和图S4所示。总体而言，结缔组织中的血细胞浸润和卵细胞闭锁的流行率最高。在寄生虫方面，仅在生殖腺中观察到微孢子虫Steinhausia mytilovum（图2E），但其流行率较低（图8和图S4）。

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图7. (A) 暴露于200纳米LD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）和卵细胞中的Steinhausia mytilovum（箭头）。(B) 暴露于1000纳米HD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）、卵细胞闭锁（AT）和坏死卵细胞（N）。(C) 暴露于50纳米HD的贻贝处于产卵阶段的雄性生殖腺滤泡内的血细胞浸润（*）。(D) 暴露于50纳米HD的贻贝中，雌性生殖腺滤泡（F）内残留的配子和结缔组织中的弥漫性血细胞浸润。

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图8. 对照组贻贝和暴露于低剂量（LD）和高剂量（HD）50纳米PS纳米颗粒（E1和E4）、200纳米PS纳米颗粒（E2和E5）以及1000纳米PS纳米颗粒（E3和E6）七天的贻贝的生殖腺中组织病理学改变和微孢子虫寄生虫的流行率（%）。每个实验中两个重复组的数据合并。E1和E2、E3和E4以及E5和E6共享对照组。字母表示根据χ2检验（p<0.05）发现的组间显著差异。
关于不同实验对照组之间的差异（图S2），唯一观察到的是E5-E6实验中对照组雌性贻贝的卵细胞闭锁流行率显著高于E1-E2实验的对照组雌性贻贝（图S2）。

在分析不同浓度和大小的纳米颗粒对各种改变的影响时，在E1实验中未观察到组间差异（图8）。而在E4实验中，暴露于50纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝的卵细胞闭锁流行率显著高于暴露于相同纳米颗粒低剂量（LD）的贻贝（图8），且暴露于50纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝的纤维化流行率高于对照组贻贝（图8）。

在E2实验中，对照组贻贝的结缔组织（CT）中血细胞浸润的流行率高于暴露于200纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝（图8）。然而，在E5实验中并未观察到这一现象，暴露于200纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）的贻贝的纤维化流行率高于对照组贻贝。

在E3实验中，暴露于1000纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝的结缔组织（CT）中血细胞浸润的流行率高于对照组，而暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）和高剂量（HD）的贻贝的纤维化流行率也高于对照组（图8）。在E6实验中，唯一显著的组间差异是对照组贻贝的卵细胞闭锁流行率高于暴露于1000纳米PS纳米颗粒低剂量（LD）的贻贝（图8）。

3.6 纳米颗粒暴露和混杂因素的影响
同时研究了纳米颗粒暴露（不同大小和浓度）和混杂因素（性别、配子发育阶段、寄生虫存在）作为可能影响数据的固定因素，而重复实验（水族箱）之间的差异作为随机效应。在所有情况下，随机效应的方差均值为1，因此可以忽略固定因素间差异来源于重复水族箱间差异的可能性。
在贻贝中测量的四个病理学指标中观察到了固定变量之间的相互作用：消化上皮萎缩（DE）、消化上皮坏死（DE）、卵细胞闭锁以及生殖腺结缔组织中的血细胞浸润（图9和表S3-S7）。

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图9. 从广义线性混合模型获得的固定效应的相关性图，显示了四个表现出显著差异的病理学指标之间的相互作用方向（负值：蓝色，正值：红色）及其系数（括号内）：A）消化上皮萎缩（DE），B）消化上皮坏死（DE），C）卵细胞闭锁（AT），D）生殖腺结缔组织中的血细胞浸润（T）。
综合考虑所有实验的数据，暴露于50纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝的消化上皮萎缩流行率高于暴露于低剂量（LD）和200纳米PS纳米颗粒高剂量（HD）的贻贝（图9A，表S4）。在消化上皮坏死、卵细胞闭锁以及生殖腺结缔组织中的血细胞浸润的情况下，仅考虑纳米颗粒（NPs）的暴露时，未观察到显著差异（图9B，表S5-S7）。性别、配子发育阶段和寄生虫的存在本身并不能解释所研究病理学现象中的任何差异（图9，表S3-S7）。然而，这些混杂因素中的一个或两个与纳米颗粒暴露类型之间的相互作用显著影响了所研究的病理学现象，如下所述以及图9和表S3-S7所示。对于消化腺萎缩，当暴露类型为4时，纳米颗粒暴露类型与胃肠道（GI）之间存在显著相互作用；对于雌性，纳米颗粒暴露类型与性别之间存在显著相互作用；对于不同寄生虫，纳米颗粒暴露类型与寄生虫的存在也存在显著相互作用。此外，纳米颗粒暴露类型与两个混杂因素的组合（“纳米颗粒暴露 * 胃肠道 * 寄生虫”；“纳米颗粒暴露 * 性别 * 寄生虫”以及“纳米颗粒暴露 * 性别 * 胃肠道”）导致了多个显著相互作用（图9A和表S4）。对于消化上皮坏死，当暴露类型为4时，纳米颗粒暴露类型与胃肠道之间存在显著相互作用；当贻贝被单一寄生虫感染时，纳米颗粒暴露类型与寄生虫的存在也存在显著相互作用。与消化腺萎缩类似，“纳米颗粒暴露 * 胃肠道 * 寄生虫”；“纳米颗粒暴露 * 性别 * 寄生虫”以及“纳米颗粒暴露 * 性别 * 胃肠道”的组合也导致了多个显著相互作用（图9B和表S5）。在卵细胞闭锁的情况下，当暴露类型为4时，纳米颗粒暴露类型与胃肠道之间存在显著相互作用；当贻贝被单一寄生虫感染时，纳米颗粒暴露类型与寄生虫的存在也存在显著相互作用。最后，在生殖腺结缔组织中的血细胞浸润情况下，当贻贝被单一寄生虫感染时，纳米颗粒暴露类型与寄生虫的存在之间存在显著相互作用。根据GLMM分析，这些混杂因素（性别、配子发育阶段和寄生虫的存在）本身并不能解释所研究病理学现象中的任何差异，而其中一个或两个混杂因素与纳米颗粒暴露类型之间的相互作用显著影响了一些病理学现象。

4. 讨论
在本研究中，评估了三种不同大小的颗粒状污染物（PS NPs）在两种不同名义浓度下通过食物途径暴露对海洋贻贝的潜在组织病理学效应，贻贝被广泛用作遗留污染物和新兴污染物的生物指示剂和哨兵（Cajaraville等人，2000年；Farrington等人，2016年；Bessa等人，2019年；Li等人，2019年；Provenza等人，2022年）。PS NPs与微藻一起施用于贻贝，因此研究了消化腺，因为它代表了这些污染物的主要积累器官（Wang等人，2021年；Gon?alves等人，2022年；Gon?alves等人，2023年），尤其是在食物途径暴露后（Paul-Pont等人，2016年；González-Soto等人，2019年）。由于配子的变化对繁殖和物种生存至关重要，因此也研究了生殖腺。组织病理学分析特别关注涉及血细胞的炎症反应，因为已有报道表明微塑料（MPs）和纳米颗粒（NPs）会在不同生物体内引发炎症反应（De Sá等人，2018年；Yang等人，2022年；Zhang等人，2022年；Hodkovicova等人，2022年）。实际上，炎症反应可以作为监测海洋环境中MPs和NPs污染的生物标志物。实验持续三周，使用了不同批次的贻贝，因此使用广义线性混合模型（GLMM）研究了性别、配子发育阶段和寄生虫存在的潜在影响。
实际上，不同批次贻贝的繁殖状态存在差异。在E1–E2组中，贻贝主要处于配子发生后期（雄性比雌性更晚）；在E3–E4组中，大多数个体处于产卵阶段；在E5–E6组中，它们主要处于成熟生殖腺阶段。这些差异反映在E3–E4组的生殖腺指数值较低，这与E3–E4组贻贝适应期间的配子释放情况以及较低的生理条件指数值相符（González-Soto等人，2025年）。GLMM分析证实，贻贝的性别和繁殖状态以及寄生虫的存在影响了暴露于NPs后的组织病理学改变的普遍性（表S3）。需要强调的是，这些混杂因素本身并不能解释所研究病理学现象中的任何差异，而其中一个或两个混杂因素与纳米颗粒暴露类型之间的相互作用显著影响了一些病理学现象，如下所述。
在消化腺中，对照组显示出多种组织病理学改变的高发率，特别是结缔组织中的血细胞浸润、纤维化、消化上皮坏死（DE）和DE萎缩。DE萎缩与应激情况有关，包括营养应激、产卵后应激和不同污染物的暴露，这可能导致上皮异常变薄，最终导致消化管萎缩（Kim等人，2006年；Bignell等人，2012年）。E1–E2组和E3–E4组的DE萎缩发生率显著高于E5–E6组。繁殖状态并不是造成这种差异的唯一因素，因为E1–E2组和E3–E4组的贻贝处于不同的配子发生阶段。所有实验的喂养制度相同，因此食物可用性无法解释观察到的差异。对照组贻贝中DE坏死、纤维化和血细胞浸润的高发率可能与样本中存在病原体等因素有关。这些病原体可能触发宿主体内的多种炎症反应或其他组织病理学改变（Villalba等人，1997年；Kim等人，2006年）。E3–E4组对照组中细胞内纤毛虫MPX的发生率高于E1–E2组和E5–E6组。E3–E4组贻贝因产卵而产生的虚弱可能促进了寄生虫的增殖。然而，在GLMM分析中，胃肠道（GI）与寄生虫存在之间的相互作用不足以解释对照组贻贝中观察到的组织病理学差异。
考虑到对照组和不同实验中暴露于NPs的贻贝，观察到结缔组织（CT）中血细胞浸润、纤维化、DE坏死和DE萎缩的高发率。然而，对照组和暴露组之间仅发现了一些统计学上的显著差异（表1）。令人惊讶的是，在实验E1中，对照组贻贝的DE坏死发生率高于暴露于50纳米PS NPs的高剂量（HD）组贻贝。同样，对照组贻贝在消化腺结缔组织中棕色细胞的发生率高于暴露于200纳米PS NPs的高剂量（HD）组贻贝。E5组中，对照组贻贝的DE坏死发生率也高于暴露于200纳米PS NPs的高剂量（HD）组贻贝，以及E6组中暴露于1000纳米PS NPs的低剂量（LD）和高剂量（HD）组贻贝。另一方面，在E5组中，200纳米HD组中Marteilia和Mytilicola的发生率高于对照组。GLMM分析证实，寄生虫的存在显著影响了对照组和暴露于50纳米PS NPs的低剂量（LD）和高剂量（HD）组以及200纳米PS NPs的低剂量（LD）组贻贝的DE坏死发生率。
表1. 贻贝暴露于三种不同大小PS NPs的主要发现总结。LD：低剂量；HD：高剂量。E1）暴露于50纳米PS NPs；E2）暴露于200纳米PS NPs；E3）暴露于1000纳米PS NPs；E4）第二次独立暴露于50纳米PS NPs；E5）第二次独立暴露于200纳米PS NPs；E6）第二次独立暴露于1000纳米PS NPs。n.e.：未观察到效应。实验E1和E2、E3和E4以及E5和E6同时进行，并共享对照组。CT：结缔组织；DT：消化道；DE：消化管上皮；GI：生殖腺指数；F：生殖腺滤泡。
对照组之间的差异
与对照组相比的差异
50纳米
200纳米
1000纳米
消化腺
CT中的棕色细胞
n.e.
n.e.
E2
200纳米HD ↓
E3
1000纳米LD & HD ↓
纤维化
n.e.
n.e.
n.e.
E3
1000纳米LD ↑
DE萎缩
E5–6组低于E1–2组和E3–4组
n.e.
n.e.
E3
1000纳米LD ↓
DE坏死
n.e.
E1
50纳米HD ↓
E5
200纳米HD ↓
E3
1000纳米LD ↑
E6
1000纳米LD & HD ↓
生殖腺
E5–6组在雌性贻贝中高于E3–4组
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
卵细胞闭锁
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
卵细胞坏死
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
CT中的棕色细胞
n.e.
n.e.
n.e.
E1：200纳米HD ↓
E3：1000纳米HD ↑
纤维化
n.e.
E4
50纳米HD ↑
n.e.
E3
1000纳米LD & HD ↑
寄生虫
RCLO
n.e.
n.e.
E2
200纳米HD ↑
n.e.
Marteilia sp.
n.e.
n.e.
E5
200纳米HD ↑
n.e.
Mytilicola sp.
n.e.
n.e.
E5
200纳米HD ↑
n.e.
细胞内纤毛虫
E5–6组低于E1–2组和E3–4组
E4
50纳米LD & HD ↓
n.e.
E3
1000纳米LD & HD ↓
另一方面，在E3组中，暴露于1000纳米NPs低剂量的贻贝组显示出纤维化和DE坏死的发生率显著高于对照组，而DE萎缩的发生率较低。这些效应在E6组中没有观察到，因此我们不能确定这些效应是由于暴露于1000纳米PS NPs的低剂量（LD）引起的。同样，这些效应似乎与寄生虫的存在无关（仅在E3和E4组的对照组中观察到MPX细胞内纤毛虫的发生率较高）。一种可能的解释是，E3组中1000纳米LD组的效应是由于该组中的雄性贻贝处于不同的配子发生阶段（成熟生殖腺与产卵阶段相比）。在GLMM分析中，对照组贻贝和暴露于1000纳米NPs的贻贝在DE坏死和DE萎缩方面没有观察到差异。
关于血细胞浸润，与对照组相比，处理NPs的组别中没有观察到显著差异，这与其他研究将MPs和NPs的暴露与血细胞浸润增加联系起来的结果相反（González-Soto等人，2019年；Sendra等人，2020年；Sendra等人，2021年；Hodkovicova等人，2022年）。由于贻贝具有开放的循环系统，其组织中存在血细胞是常见的（Bignell等人，2012年），但血细胞浸润以及粒细胞瘤的形成被认为是对各种应激源的普遍反应，如组织损伤、寄生虫存在、产卵后应激或污染物暴露（Kim等人，2006年；Garmendia等人，2011年；Bignell等人，2012年）。结缔组织中棕色细胞的积累也是如此，在E3组的对照组中观察到更高的发生率，而在暴露于NPs的贻贝中则较低；在E2组中，暴露于200纳米HD的贻贝中观察到更高的发生率。根据GLMM分析，只有DE萎缩是唯一受NPs暴露单独影响的病理现象。因此，暴露于50纳米PS NPs高剂量（HD）的贻贝显示出比暴露于低剂量（LD）和200纳米PS NPs及1000纳米PS NPs的贻贝更高的DE萎缩发生率。消化管上皮萎缩通常由消化细胞的丢失引起（Kim等人，2006年；Bignell等人，2012年）。较小的NPs可以更容易地被消化腺细胞内化，相比之下较大的NPs则不易（Wang等人，2021年）。因此，50纳米的PS纳米颗粒能够引起损伤，这可能与纳米颗粒被细胞内化有关，而较大的纳米颗粒（200纳米和1000纳米）则会导致组织损伤，这可能与纳米颗粒存在于细胞之间有关。此外，纳米颗粒暴露与病原体存在之间的相互作用对贻贝的消化道萎缩和坏死的发生率有显著影响。进一步的研究表明，“纳米颗粒暴露*消化道*病原体存在”、“纳米颗粒暴露*性别*病原体存在”以及“纳米颗粒暴露*性别*消化道”这些三级交互作用在消化道萎缩和坏死的情况下也具有显著性，表明所研究的混杂因素调节了纳米颗粒对这些结果的影响。

在生殖腺中，对照组显示出结缔组织中血细胞浸润和卵细胞萎缩的高发生率。实验在9月和10月进行。据描述，来自加利西亚的Mytilus galloprovincialis贻贝有两个产卵期：主要的一个在春季，此时产卵量大且有效，卵泡可能完全空虚且没有储备组织；另一个在秋季，产卵效果较差，并伴有储备组织和卵细胞萎缩（Villalba, 1995; Suárez et al., 2005）。与此一致，在E3–E4和E5–E6阶段观察到了贻贝处于产卵和产卵后阶段。此外，如前所述，在E3–E4阶段的个体在实验室适应期间释放了配子。因此，对照组中观察到的血细胞浸润和卵细胞萎缩的一个可能因素是产卵引起的应激，在E5–E6阶段观察到的萎缩发生率显著高于E1–E2阶段。产卵是一个能量消耗巨大的过程，在没有刺激诱导产卵的情况下，卵细胞会经历裂解和物质重新吸收以生成新的储备细胞（Suárez et al., 2007）。这一过程可以通过生殖腺切片中的萎缩卵细胞和积极吸收降解物质的血细胞来观察。

关于食物中的纳米颗粒暴露对生殖腺的影响，各组之间没有发现显著差异（表1）。实际上，在比较每次实验的对照组和暴露组时，没有观察到卵细胞萎缩发生率的显著差异。然而，在广义线性混合模型（GLMM）中，纳米颗粒暴露与混杂因素之间的不同交互作用对卵细胞萎缩的发生率有显著影响。例如，在暴露于200纳米PS纳米颗粒的贻贝中，纳米颗粒暴露与消化道和病原体存在之间的交互作用显著。同样，在暴露于50纳米PS纳米颗粒和200纳米PS纳米颗粒的贻贝中，纳米颗粒暴露与病原体存在之间的交互作用也显著。此外，在暴露于高剂量（HD）200纳米PS纳米颗粒且感染了一种病原体的贻贝中，“纳米颗粒暴露*消化道*病原体存在”这一三级交互作用显著，表明这两个混杂因素调节了纳米颗粒对卵细胞萎缩的影响。

在所有实验中，生殖腺中血细胞浸润的发生率是唯一一个有显著变化的参数。在E2阶段，200纳米HD组的血细胞浸润发生率低于其他所有组。在E3阶段，1000纳米HD组的结缔组织中血细胞浸润发生率高于对照组和1000纳米LD组。GLMM再次证实，这些变化可以通过纳米颗粒暴露与病原体存在之间的显著交互作用来解释，特别是在感染了一种病原体的贻贝中，对照组贻贝与暴露于200纳米PS纳米颗粒HD的贻贝之间。此外，在E3阶段，暴露于高剂量HD且感染了一种病原体的贻贝中，“纳米颗粒暴露*消化道*病原体存在”、“纳米颗粒暴露*性别*病原体存在”以及“纳米颗粒暴露*性别*消化道”这些三级交互作用在生殖腺结缔组织中的血细胞浸润情况下也具有显著性。另一方面，在E3阶段，暴露于1000纳米HD和1000纳米LD的贻贝中观察到纤维化发生率高于对照组。同样，在E4阶段，暴露于50纳米HD的贻贝中也观察到纤维化发生率高于对照组。

在不同的实验中未检测到雌雄同体个体，也未观察到性别比例或其他与内分泌干扰物暴露相关的改变（Ortiz-Zarragoitia和Cajaraville, 2010, Arienzo et al., 2019）。在GLMM中可以观察到，贻贝的性别在消化道萎缩、消化道坏死和生殖腺结缔组织血细胞浸润的情况下与纳米颗粒暴露有关。关于生殖腺指数（GI）的差异，E3–E4组的雌性贻贝的GI值显著低于E1–E2和E5–E6组的对照组，这是由于产卵造成的。根据Choi等人（2022）的研究，MPs污染会导致GI降低，因为暴露的个体表现出产卵阶段减少，以及更早甚至未分化的配子发育阶段增加。MPs和纳米颗粒可能导致饥饿和能量代谢紊乱（Wegner et al., 2012），不仅影响生长，还影响整个生殖过程（Choi et al., 2022）。GI对纳米颗粒暴露的干扰在四种病理学情况下都有显著交互作用，这再次强调了这一能量消耗巨大过程对于解释贻贝中观察到的组织病理学改变的重要性。

因此，生殖状态是解释对纳米颗粒暴露反应的关键变量，但病原体的存在也有影响，这一点在GLMM中得到了体现。Villalba等人（1997）根据病原体对宿主的影响将其分为三类：第一类是致病性几乎不可察觉的病原体；第二类是引起明显但非致命损害的病原体；第三类是引起严重甚至致命损害的病原体。在研究的样本中发现了属于这三类的病原体。第一类包括RCLOs，这些是细胞内寄生的原核生物，几乎不会在宿主体内引发炎症反应（Cajaraville et al., 1991; Villalba et al., 1997; Darriba Cou?ago, 2017）。另一种被认为是共生体的原生动物MPX或细胞内纤毛虫也属于第一类，尽管这种原生动物不会对宿主造成损害（Villalba et al., 1997），但在高浓度下可能会导致多种器官的功能障碍（Darriba Cou?ago, 2017, INTECMAR, 2018）。近年来，在加利西亚养殖的贻贝的消化腺中发现了这些纤毛虫的数量增加（INTECMAR, 2018）。Fichi等人（2018）报告称，受这种寄生虫感染的贻贝组织出现坏死，并且这种寄生虫能够逃避宿主的血细胞反应。González-Soto等人（2023）还发现这些寄生虫的存在与Mundaka（巴斯克地区Urdaibai生物圈保护区）采样的贻贝中坏死消化管的高发生率有关。

桡足类Myliticola intestinalis和微孢子虫Steinhausia mytilovum被归为第二类。M. intestinalis栖息在Mytilus属贻贝的消化道中，会导致宿主状况恶化（Villalba et al., 1997）和消化道上皮损伤（Darriba Cou?ago, 2017），但不会引起严重的炎症反应。此外，它是加利西亚Mytilus属贻贝中非常普遍的病原体之一（INTECMAR, 2021）。对于微孢子虫，它会导致宿主一定程度的炎症反应（Villalba et al., 1997, Rayyan and Chintiroglou, 2003, Sie-Maen Chong, 2022），这种反应在感染该病原体的样本和生殖腺卵泡内观察到。这种寄生虫会影响卵细胞的细胞质，形成含有大量孢子的球形囊肿（Sagristà et al., 1998）。这种寄生虫在卵细胞中的存在可能导致不孕或宿主生殖能力下降（Villalba et al., 1997, Carella et al., 2015），尽管在本研究中S. mytilovum的发生率较低。

最后，Marteilia属寄生虫被归为第三类。这种原生动物在加利西亚海岸很常见，会影响消化腺并引起宿主的多种反应（Villalba et al., 1997, INTECMAR, 2018, INTECMAR, 2021）。它是多种双壳类软体动物高死亡率的原因（Berthe et al., 2004, Carrasco et al., 2015）。它还会导致消化吸收效率降低、生殖腺生长和组织发育受阻以及宿主状况恶化（Villalba et al., 1997）。宿主的反应包括消化腺结缔组织中的严重血细胞反应以及粒细胞瘤的出现（Villalba et al., 1993）。本研究中使用的贻贝来自加利西亚Porto do Son（Muros河口附近）采集的种子，然后在Vilagarcía（Ría de Arousa, 加利西亚）的筏子上养殖，在那里它们可能感染了这种寄生虫和其他寄生虫（INTECMAR, 2021）。此外，本研究中发现的Marteilia属寄生虫的发生率（5-30%）远高于之前在该地区报告的比率（INTECMAR, 2021）。这种寄生虫与细胞内纤毛虫MPX一起可能是导致本研究中贻贝状况的原因之一。

总之，在消化腺中观察到血细胞浸润、纤维化、萎缩和消化道上皮坏死的高发生率，但在大多数情况下，不能仅将这些改变归因于所研究的纳米颗粒的不同大小和浓度暴露。单独暴露于纳米颗粒仅显著影响了消化道萎缩的发生率，而纳米颗粒暴露与混杂因素（性别、配子发育阶段和病原体存在）的交互作用解释了消化道萎缩和坏死发生率的差异。同样，生殖腺中观察到的血细胞浸润和卵细胞萎缩的发生率也受到纳米颗粒暴露与这些混杂因素之间交互作用的影响。特别是在E3–E4和E5–E6阶段的产卵过程中产生的应激以及不同病原体的存在极大地影响了贻贝对纳米颗粒暴露的反应。基于本研究的结果和González-Soto等人（2025）的相关工作，似乎炎症反应（如血细胞浸润和纤维化）不能作为贻贝中纳米颗粒暴露的生物标志物，至少在测试的名义浓度和短期暴露下是这样，因为其他因素如生殖阶段和寄生虫感染也会影响这些炎症反应。

总体而言，生殖状态和病原体的存在共同导致了观察到的组织病理学改变，通过改变纳米颗粒暴露对研究病理的影响。Villalba等人（1997）根据病原体对宿主的影响将其分为三类：第一类是致病性几乎不可察觉的病原体；第二类是引起明显但非致命损害的病原体；第三类是引起严重甚至致命损害的病原体。在研究的样本中发现了属于这三类的病原体。第一类包括RCLOs，这些是细胞内寄生的原核生物，几乎不会在宿主体内引发炎症反应（Cajaraville et al., 1991; Villalba et al., 1997; Darriba Cou?ago, 2017）。另一种被认为是共生体的原生动物MPX或细胞内纤毛虫，虽然这种原生动物不会对宿主造成损害（Villalba et al., 1997），但在高浓度下可能会导致多种器官的功能障碍（Darriba Cou?ago, 2017, INTECMAR, 2018）。此外，近年来在加利西亚养殖的贻贝的消化腺中发现了这些纤毛虫的数量增加（INTECMAR, 2018）。Fichi等人（2018）报告称，受这种寄生虫感染的贻贝组织出现坏死，并且这种寄生虫能够逃避宿主的血细胞反应。González-Soto等人（2023）还发现这些寄生虫的存在与Mundaka（Urdaibai生物圈保护区，巴斯克地区）采样的贻贝中坏死消化管的 high 发生率有关。

桡足类Myliticola intestinalis和微孢子虫Steinhausia mytilovum被归为第二类。M. intestinalis栖息在Mytilus属贻贝的消化道中，会导致宿主状况恶化（Villalba et al., 1997）和消化道上皮损伤（Darriba Cou?ago, 2017），但不会引起严重的炎症反应。此外，它是加利西亚Mytilus属贻贝中非常普遍的病原体之一（INTECMAR, 2021）。对于微孢子虫，它会导致宿主一定程度的炎症反应（Villalba et al., 1997, Rayyan and Chintiroglou, 2003, Sie-Maen Chong, 2022），这种反应在感染该病原体的样本和生殖腺卵泡内观察到。这种寄生虫会影响卵细胞的细胞质，形成含有大量孢子的球形囊肿（Sagristà et al., 1998）。这种寄生虫在卵细胞中的存在可能导致不孕或宿主生殖能力下降（Villalba et al., 1997, Carella et al., 2015），尽管在本研究中S. mytilovum的发生率较低。

最后，Marteilia属寄生虫被归为第三类。这种原生动物在加利西亚海岸很常见，会影响消化腺并引起宿主的多种反应（Villalba et al., 1997, INTECMAR, 2018, INTECMAR, 2021）。它是导致多种双壳类软体动物高死亡率的原因（Berthe et al., 2004, Carrasco et al., 2015）。它还会导致消化吸收效率降低、生殖腺生长和组织发育受阻以及宿主状况恶化（Villalba et al., 1997）。宿主的反应包括消化腺结缔组织中的严重血细胞反应以及粒细胞瘤的出现（Villalba et al., 1993）。本研究中使用的贻贝来自加利西亚Porto do Son（Muros河口附近）采集的种子，然后在Vilagarcía（Ría de Arousa, 加利西亚）的筏子上养殖，在那里它们可能感染了这种寄生虫和其他寄生虫（INTECMAR, 2021）。此外，本研究中发现的Marteilia属寄生虫的发生率（5-30%）远高于之前在该地区报告的比率（INTECMAR, 2021）。这种寄生虫与细胞内纤毛虫MPX一起可能是导致本研究中贻贝状况的原因之一。

总之，在消化腺中观察到血细胞浸润、纤维化、萎缩和消化道上皮坏死的高发生率，但在大多数情况下，不能仅将这些改变归因于所研究的纳米颗粒的不同大小和浓度暴露。单独暴露于纳米颗粒仅显著影响了消化道萎缩的发生率，而纳米颗粒暴露与混杂因素（性别、配子发育阶段和病原体存在）的交互作用解释了消化道萎缩和坏死发生率的差异。同样，生殖腺中观察到的血细胞浸润和卵细胞萎缩的发生率也受到纳米颗粒暴露与这些混杂因素之间交互作用的影响。特别是在E3–E4和E5–E6阶段的产卵过程中产生的应激以及不同病原体的存在极大地影响了贻贝对纳米颗粒暴露的反应。根据本研究的结果和González-Soto等人（2025）的相关工作，似乎炎症反应（如血细胞浸润和纤维化）不能作为贻贝中纳米颗粒暴露的生物标志物，至少在测试的名义浓度和短期暴露下是这样，因为其他因素如生殖阶段和寄生虫感染也会影响这些炎症反应。总体而言，生殖状态和病原体的存在通过改变纳米颗粒暴露对研究病理的影响而促进了观察到的组织病理学改变。尚需确定长期暴露是否会导致更严重的组织病理学改变，无论贻贝的生理状态如何。此外，还需要进一步研究环境中的实际老化纳米颗粒，因为它们可能比原始纳米颗粒带来额外的风险。

**作者贡献声明：**
Tania Ramírez：写作 - 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、方法学、数据分析。
Nagore González-Soto：写作 - 审稿与编辑、可视化、方法学、研究、数据分析。
Tamer Hafez：写作 - 审稿与编辑、方法学、研究。
Marisa Sárria Pereira de Passos：写作 - 审稿与编辑、方法学、研究、概念化。
Eider Bilbao：写作 - 审稿与编辑、研究、概念化。
Amaia Orbea：写作 - 审稿与编辑、研究、概念化。
Douglas Gilliland：写作 - 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。米格尔-安赫尔·塞拉-贝尔特兰（Miguel-ángel Serra-Beltrán）：负责写作（包括审稿与编辑）、项目管理工作、调查研究、资金筹集以及概念构思。
米伦·P·卡哈拉维莱（Miren P. Cajaraville）：同样负责写作（包括审稿与编辑）、初稿撰写、内容验证、项目监督、资源协调、项目管理工作、调查研究、资金筹集以及数据整理与处理，并参与概念构思工作。