高海拔冰川前湖泊中DOM（Dispersed Organic Matter，分散有机质）与汞甲基化酶的耦合：对不同补给期的响应

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Coupling of DOM and mercury methylators in nascent high-altitude proglacial lakes: A response to different recharge periods

　　光丽木 | 梅琪黄 | 青扬 | 李晓东 | 刘双 | 严冉 | 崔红阳 | 崔小宇 | 吕印东
天津大学环境科学与工程学院，中国天津市300072

**摘要**
人为气候变化导致了冰川退缩以及随之而来的冰川前生态系统的演变，这是地球上最快的生态转型之一。这一过程直接影响了冰川前湖泊，而这些湖泊是下游地区的重要水源，从而对水资源安全构成了重大威胁。冰川融水输入在不同的补给期间改变了溶解有机物（DOM）和汞（Hg）甲基化菌之间的相互作用。汞甲基化菌通过特定的代谢途径将无机汞转化为高毒性的甲基汞（MeHg）。然而，不同补给期间汞甲基化、DOM降解以及相关功能基因之间的耦合机制尚不清楚。本研究调查了青藏高原新形成的冰川前湖泊中DOM和潜在汞甲基化菌的变化情况。分析结果显示，在冰川补给期（12±7%）甲基汞/总汞（MeHg/THg）的比率显著高于非冰川补给期（5±2%），表明汞甲基化潜力增强。比较基因组分析和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）分析表明，在冰川补给期间，尤其是长链脂肪酸（类脂质成分）的供应量增加（10.11±3.57 vs 2.21±1.35），这促进了非传统汞甲基化菌（如Smithella和Goldbacteria）的生长和活性。这种刺激可能是通过与产甲烷菌的共生作用实现的，最终增强了沉积物中的汞甲基化潜力。我们的发现强调了高海拔新形成冰川前湖泊中微生物群落变化与DOM组成之间的显著相互作用，揭示了汞甲基化和甲烷产生的双重风险，强调了将这些相互关联的过程纳入未来气候变化背景下冰川前生态系统生态风险评估的必要性。

**1. 引言**
冰川是地球气候和水文系统结构和功能的重要组成部分[1]。气候变暖导致了全球冰川的大规模退缩，这一趋势在过去几十年里显著改变了陆地地貌[2]。2000年至2023年间，全球冰川的总质量变化（与海平面上升相关）为-6542±387 Gt[3]。青藏高原拥有全球最广泛的冰川覆盖范围，为约20亿人提供可靠的水源，并对气候变暖高度敏感[4],[5]。当融水自然积聚时，冰川前湖泊可能在冰川前沿形成[6]。1976年至2020年间，小型冰川前湖泊的增多是青藏高原最显著的景观变化，预计未来将有16,000个这样的湖泊形成[7],[8],[9]。源自冰川的溶解有机物（DOM）是固态碳的重要来源，对下游生态系统具有高度生物可利用性[10]。随着全球变暖的加剧，到2050年冰川质量损失可能会导致碳储备减少多达15 Tg C[11]。DOM因其来源的多样性而具有高度的结构复杂性[12]。针对青藏高原的研究表明，老虎沟和东克马迪冰川的DOM组成主要由微生物产生的蛋白质和脂质主导[13]。冰川补给河流中含有大量的富含蛋白质的物质[14]。随着冰川退缩并释放复杂的DOM成分，冰川前湖泊成为微生物活动和DOM沉积的关键热点[15]。冰川退缩还可能改变冰川前湖泊中痕量污染物（如汞（Hg）引起的生态风险[16]。作为一种有毒重金属，汞因其固有的毒性、远距离传输能力和在生态系统中的生物累积倾向而受到广泛关注[17]。许多研究关注了冰川环境中汞的风险[18],[19],[20],[21]。相比之下，吴某研究[22]调查了271个全球湖泊，发现湖水中总汞（THg）平均浓度为2.7 ng/L。然而，青藏高原雪中和冰川前湖泊水中的THg浓度分别为24.4–172.1 ng/L和2.3–8.04 ng/L[23],[24]。汞甲基化菌可以将无机汞转化为甲基汞（MeHg），这是一种高毒性的有机形式。在缺氧和硫酸盐可利用性的驱动下，硫酸盐还原菌（SRB）在厌氧冰川前湖泊中增殖，它们的数量与MeHg水平密切相关，证实了它们在汞甲基化过程中的关键作用[25],[26],[27]。通过包括Wolfe循环在内的产甲烷途径的代谢活动，产甲烷菌在低温生态系统中起到关键作用，同时提供必要的甲基基团[28],[29],[30]。除了广为报道的经典汞甲基化菌（如SRB、铁还原菌（IRB）和产甲烷菌）外，还存在一些非传统的汞甲基化菌，如Goldbacteria和Smithella[31],[32]。冰川融水中的DOM输入与MeHg生成之间存在强烈的正相关性，这种输入被认为是这一现象的关键驱动因素[33],[34]。青藏高原冰川前湖泊中心沉积物中高水平的THg和MeHg表明了汞的广泛沉积和甲基化过程，这些过程由冰川融水中的有机碳输入推动[35]。尽管冰川前湖泊中的水中的MeHg浓度较低，溶解有机碳（DOC）水平也较低，但持续的DOM输入可能导致水中MeHg浓度升高[21],[23]。随着冰川的持续退缩，新兴的冰川前湖泊将成为未来研究的焦点。这些系统将成为DOM输入和微生物对汞甲基化反应的热点。因此，阐明由冰川补给差异驱动的DOM成分与基因水平上的汞甲基化途径之间的耦合关系至关重要。在这项研究中，我们收集了位于青藏高原（海拔约5500米）新形成冰川前湖泊的沉积物及其上层水样，在冰川补给期和非补给期进行了采样，并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）和三维激发-发射矩阵荧光光谱（3D-EEMs）追踪DOM组成的变化。基因组数据被用来标注汞甲基化菌及其相关基因通路。我们利用生物信息技术提出了潜在汞甲基化菌与DOM输入之间的内在联系。这种整体方法不仅加深了我们对冰川前湖泊极端环境中微生物汞甲基化的理解，还为提高冰川环境汞生态风险评估的预测能力提供了新的证据。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究地点和环境样本采集**
冰川5O270B0143（ Chinese Glacier Inventory中的编号）对应于拉萨河谷冰川1号（东经90°11′5″，北纬29°51′5″），位于宁奇唐古拉山脉的南侧（图1）。它是下游拉萨河的重要水源之一。近年来，受气候变暖驱动，青藏高原冰川加速退缩，2000至2019年间冰川质量损失速率为每年约-9.6 Gt[2]，促进了多样化冰川湖泊的发展（图1）[36]。在本研究中，我们选择了拉萨河谷冰川1号中的三个新形成的冰川前湖泊（分别命名为L1、L2和L3）。研究湖泊的物理化学性质总结在表S1中。使用World Imagery Wayback（https://livingatlas.arcgis.com/wayback/）提供的卫星图像确定了湖泊形成的时间（图1）。

**2.2. DOM在冰川前湖泊中的光学分析**
采用了多种分析方法来表征冰川前湖泊中的DOM组成。测量包括总有机碳（DOC）[38]、三维激发-发射矩阵荧光光谱（3D-EEMs）[39]和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）[40]。使用TOC-L CPN分析仪（Shimadzu，日本）测定过滤水样品中的DOC浓度。3D-EEMs使用Hitachi F-7100光谱荧光仪（日本）进行，激发波长范围为220至450 nm，发射波长范围为250至600 nm，间隔为5 nm。PMT电压设置为700 V，激发和发射的狭缝宽度为2.5 nm。使用MATLAB中的DOMFluor工具箱对EEM数据集进行了平行因子分析（PARAFAC），以识别主要荧光成分[39]。数据处理的具体细节在补充文本S1中描述。

**2.3. 冰川前湖泊中DOM的质谱分析**
使用UPLC-Q-TOF MS（Agilent/Brooke，美国）来表征DOM的分子组成，包括化合物的数量、分子式和质荷比（m/z）。为了提高仪器响应，样品在仪器分析前进行了预浓缩。使用Kinetex极性C18柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm；Phenomenex）分离DOM化合物，方法依据Capriotti的描述[41]。关于质谱参数、色谱条件和数据处理工作流的详细信息见补充信息（Text S2）。原始UPLC-Q-TOF MS数据在QI 2.3软件（Waters，美国）中进行处理，用于峰值对齐、检测和归一化[40]。在峰值检测过程中，设置了3的灵敏度设置和0.1 min的最小峰值宽度，以优化可检测离子信号并消除背景噪声。只有当检测到的峰值强度至少比程序空白值高10倍时才保留。分子式分配的测量值和计算值之间的质量误差阈值设定为<5 ppm。候选分子式的进一步筛选标准包括：O/C<1，H/C介于0.3和2之间，m/z范围为100至1000，非负整数双键当量，以及符合氮规则[42]。冰川补给期（n=6）的冰川前湖泊原始水数据来源于我们之前的研究[23]，因为该阶段的样本有限。在本研究中，这些数据与新收集的样本一起重新分析，以便更全面地探讨可归因于冰川补给的差异。2.4. 新生冰川前湖中THg和MeHg的分析我们测定了三个湖泊中地表水、深层水和沉积物样本中的THg和MeHg浓度。沉积物样本在后续分析之前需要经过消化处理。对于THg的分析，使用混合溶液（2 mol·L?1 HNO3和4 mol·L?1 HCl）进行消化[43]。消化后的所有汞种类都被BrCl氧化为Hg2+，然后用SnCl2还原为元素汞。样品制备完成后，将处理过的样本引入与Tekran 2600系统集成的吹扫-捕集系统[21]中。在这个系统中，还原的Hg0被挥发出并转移到原子荧光检测器上进行定量分析。研究人员通过添加标准Hg(NO3)2溶液验证了样品中THg测量的准确性，结果显示加标回收率为86%至114%（n=3），THg的方法检出限为0.02 ng·L?1。对于MeHg的分析，沉积物首先用硝酸（25%，v/v）和CuSO4（2 mol·L?1）进行消化，然后用CH2Cl2和超纯水进行萃取（反萃取）[43]，之后按照EPA方法1630使用气相色谱耦合冷蒸气原子荧光光谱法（CVAFS，Tekran 2500）进行测量，MeHg的加标回收率为82%至107%（n=3），方法检出限为0.004 ng·L?1[23]，[42]，[44]。平行样品的五次重复分析的相对标准偏差均小于10%。2.5. 微生物学分析为了初步调查新生冰川前湖中潜在汞甲基化菌的分布，选取了6个水样和6个沉积物样（包括冰川补给期和非补给期的底水和沉积物）进行进一步的宏基因组测序。为了构建双端文库，使用Covaris M220仪器（Gene Company Limited，中国）将DNA提取物片段化为平均约350 bp的大小。双端文库的构建使用了NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq（Bioo Scientific，奥斯汀，TX，美国）。双端测序在Illumina NovaSeq? X Plus（Illumina Inc.，圣地亚哥，CA，美国）上进行，试剂盒使用NovaSeq X Series 25B试剂盒，按照制造商的说明操作。与该项目相关的宏基因组测序数据已存入国家生物技术信息中心（NCBI）（BioProject PRJNA1380026）。为了检测hgcA基因，我们使用了HMMER v3.2.1中的hmmsearch功能，将Hg-MATE数据库中的hmm轮廓应用于每个组装生成的氨基酸FASTA文件[45]，[46]。E值<10?3的基因被视为显著 hit。为了进一步确认HMM搜索结果中的假定的hgcA基因，我们根据hgcA基因（NVWCA(A/G/S)GK）中的独特保守基序定义了高严格度阈值[45]，[47]。其他生物信息学分析及其可视化结果详见文本S3。2.6. 统计分析通过冰川前湖水中MeHg/THg比值来评估汞的甲基化潜力，其中较高的比值表示甲基化活性增强[23]，[48]。在进行统计分析之前，使用Shapiro–Wilk检验（SPSS 22.0，IBM，美国）评估数据的正态性。为了识别研究组之间的显著差异，我们进行了单因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey多重比较检验。使用网络工具包（版本1.11）[49]进行了双因素共现网络分析。我们计算了环境变量与选定物种之间的Spearman相关系数，然后使用R（版本3.3.1）的pheatmap包生成了热图进行可视化。3. 结果3.1. 冰川前湖的理化性质和DOM变化最初在三个研究湖泊中量化了DOC、营养物质（即NO2?、NO3?、PO43?）、与微生物密切相关的气象指标（即WT）以及物理指标（即TUR和DO）的浓度（图S1）。我们观察到尽管某些指标在三个湖泊之间略有差异，但它们都由同一个冰川补给。鉴于这些湖泊在之前的研究中被视为平行系统[7]，[23]，[35]，[36]，[50]，在本研究中也将它们视为平行湖泊。同时，我们主要关注同一类型的样本之间的差异，以集中研究冰川补给期（RL）和非补给期（NL，图S1）之间的变化。两个时期的冰川湖泊温度分别为8.71 ± 3.84 °C（RL）和5.48 ± 3.55 °C（RL）。尽管温度有所下降，但没有观察到显著差异。此外，RL时期的营养物质浓度（NO2?：0.004 ± 0.003 mg/L，NO3?：0.054 ± 0.036 mg/L，TN：0.161 ± 0.063 mg/L，PO43?：0.004 ± 0.001 mg/L）略高于NL时期（NO2?：0.003 ± 0.001 mg/L，NO3?：0.019 ± 0.015 mg/L，TN：0.154 ± 0.054 mg/L，PO43?：0.004 ± 0.003 mg/L），但它们仍然保持贫营养状态。TUR（RL：124.04 ± 54.77 NTU，NL：66.02 ± 16.47 NTU，P < 0.05）和EC（RL：32.00 ± 9.13 μs/cm，NL：57.58 ± 22.50 μs/cm，P < 0.05）存在显著差异，这可能归因于沉积作用和离子稀释效应的输入驱动变化。DOC浓度（RL：0.813 ± 0.233 mg/L，NL：0.955 ± 0.251 mg/L，P > 0.05）在整个研究期间保持相对较低。随后，通过3D-EEMs进一步识别了三种荧光成分（C1：类似色氨酸的，C2：类似蛋白质的，C3：类似腐殖质的）（图S2）。C1（RL：220.46 ± 35.88，NL：119.74 ± 6.69，P < 0.05）在冰川补给停止后显著减少，而C2（RL：93.46 ± 17.34，NL：314.86 ± 62.92，P < 0.05）显著增加。这种模式表明，新鲜输入的高生物可利用性DOM在补给停止后转化为了类似蛋白质的物质。相比之下，抗微生物降解的类似腐殖质的成分没有显著变化。我们进一步使用UPLC-QTOF-MS分析了两个时期DOM的分子（表S2）和元素（表S3）组成。共鉴定出2476 ± 178个分子公式（见图2），其中超过10%的公式是每个时期特有的（图S3）。值得注意的是，37%的鉴定出的DOM分子具有较低的C/N比率（≤20），表明其生物可利用性较高[51]。在所有样本中，木质素和脂质是最丰富的化合物，分别占36.85 ± 1.55%和21.85 ± 1.24%。这种模式与冰川湖泊中的先前的发现不同，但与冰斗状沉积物的结果一致，表明可能存在冰斗状沉积物的来源[12]，[51]。两个时期之间分子组成的数量没有显著差异（P > 0.05）。因此，推测3D-EEMs DOM成分的季节性变化源于这些分子相对丰度的差异，这将在后续部分进行讨论。下载：下载高分辨率图像（794KB）下载：下载全尺寸图像图2. 冰川补给期（RL）和非补给期（NL）收集的冰川前湖样本中DOM分子公式的Van Krevelen图。颜色对应不同的DOM元素组成，划分的区域表示不同类型的DOM。带星号的样本（*）的原始数据来自我们之前的研究[23]。3.2. 冰川前湖中的汞甲基化风险和潜在汞甲基化菌的变化为了明确汞甲基化风险的变化模式，我们测定了RL和NL中水（图3a）和沉积物（图3b）中的THg和MeHg浓度。RL中的THg和MeHg浓度分别为5.53 ± 3.39 ng/L和0.18 ± 0.05 ng/L，而NL中的浓度分别为9.34 ± 4.99 ng/L和0.20 ± 0.02 ng/L。然而，RL沉积物中的MeHg浓度（1.53 ± 1.06 ng/g）显著高于NL（0.48 ± 0.35 ng/g）（P < 0.05），MeHg/THg比值也是如此（RL：12 ± 7%，NL：5 ± 2%）（P < 0.05）。这表明RL中的汞甲基化潜力较高，主要表现在沉积物中。相比之下，水柱中的MeHg似乎受其他过程（如光还原[62]）的调节。因此，我们将重点放在沉积物中的微生物变化上，作为后续研究的核心。利用宏基因组数据集，鉴定并注释了25种潜在的汞甲基化菌（图3c）。虽然SRB在汞甲基化菌中占主导地位，但也检测到了少量的甲烷生成菌（图3d）。Desulfobacteria在RL中占比约为36.7%，但在NL中降至4.3%，而Desulfuromonadia从RL的42.7%增加到NL的74.5%。根据从先前研究编译和整合的基因途径图（图4）[28]，[52]，KEGG注释结果表明SRB中的乙酰-CoA途径是完整的，而Wolfe循环（mtrABCDEFGH）代表的氢营养型甲烷生成途径和传统的甲基营养型甲烷生成途径（mtaA，mtbABC）要么缺失，要么表达较弱。尽管由于技术限制可能存在未检测到的情况，但这些发现仍然表明该环境中的汞甲基化主要由SRB主导。出乎意料的是，NL时期的乙酰-CoA途径（metF和cdhDE，P < 0.05）略强于RL时期，这与我们的观察结果相反，即RL时期的汞甲基化潜力高于NL时期（P < 0.05）。然而，之前研究不足的汞甲基化菌如Goldbacteria（具有纤维素降解能力）和Smithella（与甲烷生成菌密切相关）的鉴定引起了我们的注意（图S4）。它们的丰度在RL中显著高于NL（P < 0.05）（图S5），这可能强烈表明它们可能会做出重要贡献。NL时期较高的乙酰-CoA途径丰度主要来自传统的SRB，而不是Smithella或Goldbacteria。尽管NL时期这种途径更为丰富，但它并没有导致更高的汞甲基化。相反，Smithella和Goldbacteria在RL中更为丰富，并通过独立于SRB类型的乙酰-CoA途径介导了汞甲基化，这很好地解释了RL时期观察到的较高汞甲基化潜力。下载：下载高分辨率图像（334KB）下载：下载全尺寸图像图3. 水（a）和沉积物（b）中的THg、MeHg浓度及MeHg/THg比值（n = 9）；通过最大似然法得到的潜在汞甲基化菌的蛋白质树（c）；冰川补给期（RL）和非补给期（NL）沉积物样本中潜在汞甲基化菌在Class水平的丰度。下载：下载高分辨率图像（138KB）下载：下载全尺寸图像图4. 汞甲基化中常见的相关甲基转移途径，包括乙酰-CoA途径、Wolfe循环和甲基营养型甲烷生成菌的代谢途径（a）以及相关基因的丰度热图（b）在冰川补给期（RL）和非补给期（NL）。3.3. 潜在汞甲基化菌与DOM之间的耦合关系冰川前湖是汞甲基化的重要场所，DOM的浓度和组成可以调节汞甲基化菌的活性（图S6）。在DOM分子和与汞相关的参数（THg、MeHg、MeHg/THg）之间进行了双因素共现网络分析（图S7，表S4）。我们筛选出相关系数为0.9的DOM分子，并发现两个时期之间的分子组成存在显著差异。值得注意的是，C27H30O14类型的分子在两个时期都与汞相关参数有显著相关性（r > 0.9）。根据UPLC-QTOF-MS的结果，它们的丰度在RL期间显著高于NL期间（8.51 ± 1.76 vs 2.09 ± 0.95）（P < 0.05）（图S8）。由于这个冰川前湖的海拔极高且周围缺乏显著植被，这些可能来源于植物次生代谢产物的化合物的检测提供了冰川在RL期间释放古老碳库的明确证据。在分析潜在汞甲基化菌和DOM组成的双因素贡献网络中，我们进一步观察到DOM组成的变化主要影响了发酵菌和脂肪酸降解菌，如Paludibacter（213个分子）和Smithella（141个分子）[32]，[54]，而不是传统的SRB（109个分子）（图5a）。从分子组成的角度来看（图5b），除了来自古老碳库的丰富木质素外，脂质作为Smithella的底物构成了第三丰富的类别。元素组成主要由CHO和CHON化合物主导（图5c），这与之前的冰川融水研究结果一致[23]。下载：下载高分辨率图像（652KB）下载：下载全尺寸图像图5. 进行了双因素共现网络分析，以探索DOM分子与潜在汞甲基化菌之间的关联（n = 6）。具体结果用三种颜色标记的节点可视化，即汞甲基化菌（a）、DOM化合物（b）和DOM元素组成（c）。同样，在与潜在汞甲基化菌最强烈相关的DOM分子中，我们识别出C18H34O2（r > 0.9），这是一种在RL中比NL中丰富得多的典型长链脂肪酸（10.11 ± 3.57 vs 2.21 ± 1.35）（P < 0.05）。这些结果进一步增强了我们对Smithella潜在作用的兴趣。通过比较分析Smithella的潜在代谢途径（图6a），发现了两条通往乙酰辅酶A形成的路径：糖酵解和长链脂肪酸β-氧化循环。重组期（RL）期间glk和ACADM的丰度较高，表明这一时期的底物处理能力得到增强。此外，观察到的metF基因的丰度表明，在重组期与汞甲基化相关的甲基转移潜力更大（图6b）。基于我们对长链脂肪酸分子的筛选（文本S4和表S6），我们发现这些化合物的多样性和丰度在重组期显著高于非重组期（图S10）。而且，它们的丰度与汞甲基化的潜在风险呈正相关（P < 0.05，见图6）。值得注意的是，Smithella通过与乙酸裂解甲烷菌的共生关系发挥作用，其中Smithella产生的乙酸被甲烷菌消耗以生成甲烷，这一过程反过来又刺激了Smithella的代谢。有趣的是，我们之前的研究已经确定该地区的主要甲烷生成菌为乙酸裂解甲烷菌，这意味着可能存在双重生态风险：MeHg和甲烷的共同排放[7]。

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图6. 潜在的汞甲基化菌（如Smithella）与乙酸裂解甲烷菌之间的耦合途径（a），以及冰川补给期（RL）和非冰川补给期（NL）关键参数的对比热图（b），以及选定的长链脂肪酸与汞甲基化潜力之间的Spearman相关性分析（c）。
注释：
glk：葡萄糖激酶；tal-pgi：转醛酶/葡萄糖-6-磷酸异构酶；C01046：N-甲基-L-谷氨酸；C00197：3-磷酸-D-甘油酸；C00631：2-磷酸-D-甘油酸；PGK：磷酸甘油酸激酶；PK：丙酮酸激酶；ACADM：酰基辅酶A脱氢酶；K01179：内葡聚糖酶；
(I) 长链脂肪酸的共生降解（长链脂肪酸 + 2CO2 + 2H2O → 2 乙酸 + 短链脂肪酸 + H+ + 4H2）

4. 讨论
这些前冰川湖泊中汞风险的增加不仅来自冰川释放的汞，还来自DOM同时输入所刺激的微生物甲基化[23]、[35]。在同一研究区域内，汞同位素分析表明，汞的形态受融水输入、大气沉积和基岩风化的影响[35]。这一现象证实了汞通过冰川消融迅速进入水生生态系统，是重组期湖泊汞输入的主要途径。相比之下，水柱中的微生物生物量较低，溶解氧较高，MeHg的光解强度较大，这掩盖了时间上的差异。来自冰川流出的同位素和其他地球化学示踪剂的数据表明，过去冰川前进期间携带的古代有机物为冰下系统中的广泛异养活动提供了底物[55]。在这些逐渐缺氧的沉积物中，来自冰川融水和下层基岩的氮、铁和硫化合物作为替代的电子供体和受体，支持厌氧呼吸和甲烷生成[56]。由于青藏高原强烈的太阳辐射[61]，其强烈的紫外线辐射可以有效驱动水生系统中MeHg的光解，产生二价汞或元素汞[62]。与非重组期相比，重组期表现出显著的更高太阳辐照度[61]、更长的日照时间和更强的紫外线辐射，这大大加速了表层水中溶解的MeHg的光解。尽管在雨季沉积物中产生的MeHg更多并扩散到水柱中，但这种输入被增强的光解作用所抵消[62]。相比之下，沉积物中的MeHg不受光照影响，并随着微生物的产 生而积累，导致两个时期之间存在显著差异。在这些极端环境中SRB的持续主导可能受到涉及冰川退缩和硫酸盐可用性增加的正反馈循环的驱动。随着冰川退缩，它们暴露出含有硫化物的底物，释放出大量的硫酸盐到融水中。在青藏高原，约69.1–77.0%的冰川径流中的硫酸盐归因于这一陆地硫化物氧化过程[47]。一个显著的例子来自喜马拉雅山脉中部的一个前冰川湖泊，20年内融水输入的增加使硫酸盐浓度从84微摩尔/升升高到327微摩尔/升，显示出与径流量的强相关性[57]。尽管未来的水文补给变化可能会改变这些来源，但目前趋势强烈支持SRB的增殖。与最近全球淡水系统的研究结果一致[58]，Desulfobacterota在重组期表现出最高的相对丰度。
与此同时，储存在冰川中的DOM被输送到湖泊中，缓解了前冰川湖泊中的碳限制[59]。在这个阶段，外源性汞的持续输入主导了水生环境中汞浓度的变化。与非补给期形成鲜明对比的是，非重组期湖泊中的汞循环主要由内部迁移过程（如表层水、深水和沉积物之间的垂直迁移）主导。缺乏有机物供应的环境减缓了潜在汞甲基化菌的代谢，减少了无机汞向MeHg的转化和积累[60]。此外，随着融水输入的停止，浑浊度显著降低。这些环境因素也影响了非传统汞甲基化菌活动的时空变化。冰川融水的输入显著增加了水体的浑浊度，这减少了紫外线的穿透和水中溶解氧的含量。这种厌氧环境不仅直接促进了Smithella和Goldbacteria等属的增殖，还支持了它们的核心代谢过程。除了降低溶解氧以创造厌氧条件外，重组期湖泊中的更高浑浊度还阻止了紫外线穿透沉积物，从而防止了关键DOM底物的光解和非传统汞甲基化菌的光失活[57]。高原强烈的太阳辐射也有助于重组期汞甲基化的风险。冰川补给的年际波动可能会通过改变上述周期变化模式，对汞的长期生态风险产生协同效应[6]。如果冰川消融加剧，补给期间THg输入的增加和持续的DOM输入可能会形成双重压力，进一步增加MeHg积累的风险[35]。冰川补给还可能通过改变DOM的来源特征和化学行为间接调节其生物可利用性[14]。在重组期，生物可利用DOM成分（包括类脂质、类碳水化合物和蛋白质/氨基糖类化合物）的峰值强度都高于非重组期，为微生物介导的汞甲基化提供了足够的底物[44]、[63]。在非重组期，湖泊中的DOM主要由微生物代谢产物组成。在这个阶段，由湖泊内微生物分解DOM产生的内源性DOM（如小分子有机酸和多糖）成为主要成分，这与3D-EEMs数据一致。DOM与汞甲基化之间的耦合模式已经发生了变化。一些我们过去没有给予足够关注的微生物可能发挥着重要作用。通过冰川补给输入的纤维素物质不能被其他微生物直接利用，但可作为Goldbacteria的补充底物[31]。作为难降解的芳香大分子，木质素不能被前冰川湖泊中的汞甲基化菌直接利用。其微生物分解仅限于少数能够分解纤维素/木质素的特化微生物（如Goldbacteria）。在重组期湖泊中，冰川木质素的增加输入显著提高了Goldbacteria的丰度（图S5）。这种细菌将木质素分解成小分子芳香化合物和有机酸，作为其他汞甲基化菌的补充碳源，从而间接增强了它们的代谢活性。相比之下，Smithella属于甲烷生成食物链的中上游[32]。通过发酵和共生过程，它们将复杂的有机物分解成简单化合物（主要是乙酸和氢气），从而直接推动了主要由乙酸裂解型和氢营养型甲烷菌主导的甲烷生成[32]。根据先前的研究，极地环境中的甲烷菌主要是氢营养型的，而该地区的甲烷菌主要是乙酸裂解型的[7]、[55]、[64]、[65]、[66]。古菌通过利用乙酸（即乙酸裂解甲烷菌）、H2/CO2（即氢营养型甲烷菌）和甲基化的C1化合物（即甲基营养型甲烷菌）产生CH4[7]。湖泊中温室气体的排放存在显著的季节性变化，特别是CH4的最大通量是最小值的104倍[50]。高海拔前冰川湖泊中由冰川融水补给引发的CH4排放不仅参与了青藏高原的区域碳循环，还与冰川退缩形成了正面的气候反馈循环，从而进一步加剧了相关的生态风险[55]。许多研究在冰川环境中检测到了这些微生物，而它们的耦合功能过程受到的关注较少[24]、[29]、[67]。值得注意的是，与氢营养型甲烷菌通过Wolfe循环的潜在汞甲基化途径不同，在那里甲基转移和甲烷生成呈现出显著负相关[28]、[30]，该地区占主导的乙酸裂解型甲烷菌很可能与汞甲基化有促进关系。这是因为甲烷菌作为高效的下游伙伴，迅速消耗H2和甲酸，从而将这些产物的浓度保持在极低水平，使Smithella的能量代谢能够持续进行[54]。Smithella的核心代谢过程（如糖发酵和β-氧化）生成一系列一碳单位载体，如甲基四氢叶酸[32]。这些分子作为HgcB甲基转移酶将甲基转移到HgcA蛋白的直接甲基供体[68]。我们认为，在前冰川湖泊的独特环境中，DOM与潜在汞甲基化菌之间的耦合，加上来自冰川退缩的底物输入增加，不仅带来了与汞甲基化相关的生态风险，还导致了甲烷排放的双重风险。

5. 结论
由于全球变暖导致的冰川加速退缩，形成了许多前冰川湖泊，增加了这些生态系统中的DOM和汞的输入及其相关的生态风险。本研究调查了青藏高原上的新兴高海拔前冰川湖泊，系统地研究了冰川融水输入如何影响物理化学参数和汞动态，特别关注DOM与潜在汞甲基化菌之间的耦合。我们的结果表明，冰川补给期提供了丰富多样的DOM成分，这些成分是潜在汞甲基化菌的关键底物。这种底物的可用性引发了微生物群落组成的变化，最终改变了参与汞甲基化途径的关键基因的丰度和表达。此外，我们确定了非传统潜在汞甲基化菌与甲烷菌之间的共生关系，这是一种之前常被忽视的机制，可能增加了冰川环境中的汞甲基化风险。通过阐明不同补给期间DOM与潜在汞甲基化菌之间的耦合，本研究增强了我们对极端环境中汞生物地球化学循环的理解，并为气候变化下这一敏感区域的生态动态提供了关键见解。