CEPD1-4在硝酸盐浓度不均匀的条件下调控棉花的根系硝酸盐吸收

《Environmental and Experimental Botany》：CEPD1-4 regulates cotton root nitrate uptake under nonuniform nitrate conditions

　　陈阳·李 | 秋月·胡 | 真·罗 | 韦·唐 | 和全·卢 | 长乐·马 | 向强·孔
山东省农业科学院工业作物研究所，济南 250100，中国

**摘要**
硝酸盐是植物吸收和利用的主要氮源，然而其在土壤中的空间分布往往是不均匀的。棉花如何响应和适应硝酸盐的不均匀性仍不清楚。在本研究中，我们发现不均匀的硝酸盐分布会诱导硝酸盐转运蛋白基因GhNRT2.1、GhNRT1.5和GhNRT1.1的表达，从而促进高硝酸盐侧根的硝酸盐吸收。低硝酸盐和不均匀硝酸盐处理会诱导棉花地上部分GhCEPD1-4的表达。在地上部分沉默GhCEPD1-4或环剥韧皮部会通过降低高硝酸盐侧根中GhNRT2.1、GhNRT1.5和GhNRT1.1的表达来抑制硝酸盐吸收。这些结果表明，GhCEPD1-4可能作为一种系统信号因子，在局部硝酸盐缺乏的情况下传递氮需求。在不均匀硝酸盐条件下，低硝酸盐侧根中GhCEP6的表达会增加。在低硝酸盐侧的根中施用CEP6肽可以诱导叶片中GhCEPD1-4的表达，并在高硝酸盐侧的根中诱导硝酸盐转运蛋白基因GhNRT2.1、GhNRT1.5和GhNRT1.1的表达。这种系统调节增强了来自高硝酸盐侧根的硝酸盐获取，从而维持地上部分的氮平衡。总之，我们的工作阐明了GhCEPD1-4在响应不均匀硝酸盐分布时协调棉花根系硝酸盐吸收的作用。

**1. 引言**
硝酸盐是植物生长发育所需的主要氮源（Wang等人，2018年；Forde和Walch-Liu，2009年；Lal，2020年）。适当的氮浓度可以促进植物生长，但随着环境中氮含量的增加，植物生长也会受到抑制（Chen等人，2025a年）。然而，如果土壤中的氮浓度不均匀，侧根会生长并扩散到氮浓度较高的区域以促进植物生长（Sun等人，2017年）。这种在营养分布不均匀的土壤环境中更有效地获取氮的机制，使得富氮土壤中的根能够生长并吸收更多氮，以补偿贫氮土壤中的根（Bellegarde等人，2017年）。调节侧根差异性发育的机制也是植物调节根系氮吸收的重要机制，涉及硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族6.3（也称为AtNRT1.1或AtNPF6.3）和硝酸盐转运蛋白2.1（AtNRT2.1）等（Remans等人，2006年；Wang等人，2018年）。植物根系可以感知环境中的NO3?浓度，并通过多种硝酸盐转运蛋白介导NO3?的吸收（Walch-Liu等人，2005年）。植物硝酸盐转运蛋白NRT1和NRT2主要分为低亲和力转运系统（LATS；在外部硝酸盐浓度高时起作用）和高亲和力转运系统（HATS；在外部硝酸盐浓度低时起作用）（Watanabe等人，2020年；Wang等人，2018年）。大多数AtNRT1转运蛋白属于LATS（Liu和Tsay，2003年），而AtNRT2转运蛋白属于HATS（Kotur等人，2012年）。作为一种双亲和力硝酸盐转运蛋白，AtNRT1.1可以在任何硝酸盐浓度下高效吸收硝酸盐（Hu等人，2015年；Fang等人，2021年）。AtNRT1.1蛋白T101位点的苏氨酸是否磷酸化决定了其两亲性（Su等人，2021年；Liu和Tsay，2003年；Sun等人，2014年）。作为硝酸盐传感器，AtNRT1.1是跨越NO3?吸收、转运、侧根发育和生长素转运的关键调节因子（Lay-Pruitt和Takahashi，2020年；Maghiaoui等人，2020年）。Medicago truncatula的MtNRT1.3也表现出与AtNRT1.1类似的双亲和力特性，在氮缺乏条件下其表达水平上调（Morère-Le等人，2011年）。在低硝酸盐浓度条件下，植物的高效硝酸盐吸收主要依赖于AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtNRT2.4和AtNRT2.5转运蛋白（Willmann等人，2014年）。AtNRT2.1是拟南芥根系HATS的主要组成部分（Laugier等人，2012年）。AtNRT2.1蛋白中Ser28和Ser501的磷酸化受外部硝酸盐浓度的调节，并在决定蛋白稳定性中起作用（Zou等人，2020年；Jacquot等人，2020年）。这表明AtNRT2.1的磷酸化修饰在调节根系硝酸盐吸收中起着重要作用（Jacquot等人，2020年）。AtNPF7.3/AtNRT1.5参与硝酸盐的长距离运输，将其运输到木质部导管中（Lin等人，2008年）。位于质膜上的AtNRT1.5在根部的原生木质部附近的厚壁细胞中表达（Lin等人，2008年），介导硝酸盐从根到地上部分的运输（Lin等人，2008年）。由于气候和地理环境等多种环境因素，土壤中的氮分布往往是不均匀的（Oldroyd和Leyser，2020年；Carly，2019年）。为了协调氮的吸收和同化以实现最佳生长，植物通过感知外部硝酸盐的可用性和内部氮状态，在根、地上部分和细胞之间整合信号（Soyano等人，2014年）。此外，它们利用长距离信号机制动态调整根系硝酸盐获取效率，以响应外部硝酸盐供应的波动（Ota等人，2020年；Ohkubo等人，2017年）。在受到不对称硝酸盐供应的拟南芥分根系统中，观察到低硝酸盐侧的根会诱导富氮侧的根进行补偿性硝酸盐吸收（Ohkubo等人，2017年）。这种植物系统的氮获取反应是由根源产生的可移动肽C末端编码的肽（AtCEP）触发的，该肽在氮缺乏的根中产生（Taleski等人，2018年）。当叶片感知到根源AtCEP时，会诱导CEP DOWNSTREAM 1（AtCEPD1）和AtCEPD2的表达，其产物可以通过韧皮部在地上部分和根之间进行长距离向下迁移，特异性地上调高硝酸盐侧根中AtNRT2.1的表达（Ohkubo等人，2017年）。在拟南芥中缺乏这一途径会导致整体氮获取反应减弱，并表现出氮缺乏症状。

棉花是一种既可作为纤维也可作为油源的工业作物（Shi等人，2025年；Le等人，2025年）。它主要利用硝酸盐进行生长发育（Li等人，2024年）。棉花中主要有42个NRT2基因和150个NPF基因（Gossypium hirsutum）（Dong等人，2022年；Pu等人，2023年）。GhHY5的表达受光照诱导，产生的GhHY5通过韧皮部运输到根中，诱导GhNRT1.1基因的表达，从而促进棉花根系的硝酸盐吸收（Wang等人，2023年）。由于硝酸盐随水流分布，土壤中的硝酸盐分布是不均匀的（Chen等人，2025b年）。先前的研究表明，棉花的GhCEP4-GhCEPR1-2-GhCEPD1-4信号通路通过在不均匀盐度条件下上调GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5的表达来调节低盐侧根的硝酸盐吸收（Li等人，2024年）。Gossypium hirsutum基因组主要由55个GhCEP基因、12个GhCEPR基因和7个GhCEPD基因组成（Li等人，2024年）。大多数基因的生物学功能尚不清楚。棉花中的GhCEP46-D05参与调节节间长度和植物高度（Mei等人，2024年）。这些表明，棉花中的CEP基因不仅参与调节根系中的硝酸盐吸收，还参与调节棉花的生长发育。然而，在不均匀硝酸盐条件下，棉花如何在高硝酸盐侧根增强硝酸盐吸收的机制仍不清楚。在本研究中，我们研究了GhCEPD1-4在不均匀硝酸盐条件下调节高硝酸盐侧根中硝酸盐吸收相关基因表达的功能。我们的发现阐明了GhCEPD1-4通过上调关键硝酸盐转运蛋白基因来促进这些根中硝酸盐吸收的机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料及生长条件
将棉花品种（Gossypium hirsutum L.）“HM1”的种子播种在干净的湿沙中，让其发芽并在光照/黑暗比为16/8小时、温度为28 ± 2℃的气候室中培养。根据Kong等人（2012年）描述的嫁接方法，选择适合嫁接的棉花幼苗。然后将棉花幼苗进行大约7天的水培培养，调整每株幼苗两侧的根系以确保均匀生长和发育。随后将嫁接幼苗两侧的根系转移到分根培养容器中继续培养。营养液每两天更换一次。营养液含有1.25 mM Ca(NO3)2、1.25 mM KNO3、0.5 mM MgSO4、0.25 mM NH4H2PO4、0.05 mM EDTA-FeNa、10 μM H3BO3、0.5 μM ZnSO4、0.5 μM MnSO4、0.0025 μM (NH4)6Mo7O24，使用KOH将pH值调整至6。

2.2. 硝酸盐处理方法
嫁接和分根三周后，选择生长均匀的棉花幼苗进行差异营养处理。设计了三个处理组：
- 不均匀硝酸盐处理（0.25/5）：一侧根系用0.25 mM NO3?的营养液处理，另一侧用5 mM NO3?的营养液处理；
- 均匀低硝酸盐处理（0.25/0.25）：两侧根系均用0.25 mM NO3?的营养液培养；
- 均匀高硝酸盐处理（5/5）：两侧根系均用5 mM NO3?的营养液培养。不同浓度的NO3?溶液中添加KCl和CaCl2以匹配5 mM NO3?溶液中的钙和钾离子（补充图2）。处理24小时后，采集叶片、接穗侧根和砧木侧根进行后续检测。

2.3. 通过种子浸泡进行病毒诱导的基因沉默
GhCEPD1-4基因沉默载体（含有烟草震颤病毒诱导的基因沉默的质粒：pTRV::GhCEPD1-4）按照Li等人（2024年）的方法构建。通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）将GhCEPD1-4基因沉默的棉花幼苗获得。将GhCEPD1-4基因沉默的棉花幼苗（接穗）与pTRV-GFP棉花幼苗（砧木）进行嫁接。接穗和砧木均为pTRV2-GFP棉花幼苗，作为对照。两侧根系分别接受以下实验处理：
- 不均匀硝酸盐处理（0.25/5：接穗侧根用0.25 mM NO3?处理，砧木侧根用5 mM NO3?处理）（补充图3）。处理24小时后，收集样本进行基因表达和相关生理指标的分析。

2.4. 环剥棉花韧皮部的实验处理
选择生长均匀的嫁接棉花幼苗（接穗和砧木均为野生型）。在实验组中，环剥一根根的韧皮部（补充图2）（Kong等人，2012年）；而在对照组中，两根根均未环剥。两组中的一侧根用0.25 mM NO3?的营养液处理，另一侧根用5 mM KNO3的营养液处理（环剥的根用高硝酸盐溶液处理）。处理24小时后，测量相关基因的表达水平、15N含量和NO3?流量（补充图4）。每种处理重复三次。

2.5. GhCEP6肽的合成
GhCEP6肽（氨基酸序列：IDRILQSVPSPGAGH）由Sangon Biotech有限公司（中国上海）合成。对于外源应用，将肽（1 μM）添加到不均匀硝酸盐处理（0.25/5）的棉花低硝酸盐侧的营养液中（作为实验组：+CEP6），或不添加（作为对照组：0），处理24小时。

2.6. RNA提取和RT-qPCR分析
将嫁接的棉花幼苗在不同硝酸盐浓度下处理24小时后，收集倒数第二片真叶和两根侧根，置于液氮中冷冻，并储存在-80℃的冰箱中。根据FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme Biotech有限公司）的说明提取总RNA，并根据HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper）（Vazyme Biotech有限公司）的说明将其逆转录为cDNA。RT-qPCR反应按照Vazyme Biotech Co., Ltd.生产的AceQ qPCR SYBR Green Master mix进行，使用的仪器是QuantStudio 1（Thermo Fisher Scientific）。以棉花的β-actin作为内参基因，目标基因的引物设计使用Primer 5.0，详见补充表S1。数据分析采用2?ΔΔCt方法。每种处理重复三次生物学实验。

2.7 叶子和根部15N含量的测定
选择了生长均匀的嫁接棉花幼苗（接穗和砧木均为野生型）。在均匀低氮和均匀高氮处理组中，分别用15N营养液处理根部的一侧。在非均匀氮处理中，用15N营养液处理高氮侧或低氮侧的根部（原营养液中的KNO3被替换为K15NO3）（见补充图2）。嫁接棉花幼苗分为三部分：地上茎叶、接穗根和砧木根。将这些部分放入不同的袋子中，在强制通风干燥机中于105℃下热处理1小时，然后在75℃下干燥至恒重。称量干重后，将样品研磨成粉末并过筛（80目）。对于15N同位素检测，将特制的铝箔杯放在精密天平上归零，称取2.5毫克样品，紧密包裹后压入铝箔杯中，使用Thermo Fisher Scientific生产的同位素质谱仪进行检测。计算公式参考Li等人（2024年）的研究。每种处理重复三次生物学实验。

2.8 根部NO3?通量的测定
使用第2.2节描述的硝酸盐差异分布方法处理24小时后（用于处理的幼苗均来自同一种植时间，在叶子和根部方面生长相对均匀），检测根部NO3?离子的流速，每种处理重复六次生物学实验。检测使用非侵入性微电极系统（Young NMT SIM-XY，美国），距离根尖800微米（每次处理的采样位置保持一致）。实验溶液包括：制备成10 mM NO3?的KNO3电极填充液；测试溶液由0.1 mM KNO3、0.1 mM KCl、0.1 mM CaCl2和0.3 mM MES组成，使用KOH和HCl溶液调节pH至6.0。样品处理和检测方法参考Li等人（2024年）的研究。

2.9 GhCEP6启动子的分析
使用PlantCARE和New PLACE识别GhCEP6启动子（2000 bp）中的顺式作用元件，随后使用Excel电子表格量化每个顺式作用元件的数量。

2.10 统计分析
数据使用SPSS 26软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），显著性差异采用Tukey检验（p<0.05）。数据使用SigmaPlot 12.5软件显示。

3. 结果
3.1 非均匀氮处理通过增加硝酸盐转运蛋白基因表达提高高氮侧根部的硝酸盐吸收
在均匀氮处理下，随着营养液中硝酸盐浓度的增加，叶子的15N含量和根部的NO3?流入速率也增加（图1A-B）。然而，在非均匀氮处理（0.25/5）中，低氮侧根部的15N含量和NO3?流入速率高于均匀氮处理（图1A-B）。此外，与均匀氮处理相比，非均匀氮处理的高氮侧根部的GhNRT2.1-1（图1C）、GhNRT2.1-2（图1D）、GhNRT2.1-3（图1E）、GhNRT2.1-4（图1F）、GhNRT2.1-5（图1G）、GhNRT1.5（图1H）和GhNRT1.1（图1I）的表达水平上调。这表明非均匀氮处理提高了棉花高氮侧根部的硝酸盐吸收效率和能力。

3.2 GhCEPD1-4通过上调高氮侧根部的GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5基因增加硝酸盐吸收
拟南芥的CEPD1和棉花的CEPD1-4作为从地上部分到根部的移动肽发挥作用（Ohkubo等人，2017年；Li等人，2024年）。在本研究中，非均匀氮处理后的棉花幼苗叶片中的GhCEPD1-4表达水平显著高于均匀低氮和均匀高氮处理后的幼苗。这表明GhCEPD1-4可能在非均匀氮处理下调节高氮侧根部的硝酸盐吸收相关基因表达。为了研究GhCEPD1-4的功能，使用GhCEPD1-4沉默的幼苗（图2C）作为嫁接植物的接穗，并将接穗设置为低氮侧。经过24小时的非均匀氮处理（用0.25 mM NO3?营养液处理接穗根部，用5 mM 15NO3?营养液处理砧木根部）后，高氮侧根部的15N含量（图3A）和NO3?流入速率（图3B）低于对照组。这表明GhCEPD1-4参与调节非均匀氮处理下的高氮侧根部的硝酸盐吸收。同时，与均匀低氮和均匀高氮处理相比，非均匀氮处理后的棉花幼苗高氮侧根部的GhNRT2.1-1（图3C）、GhNRT2.1-2（图3D）、GhNRT2.1-3（图3E）、GhNRT2.1-4（图3F）、GhNRT2.1-5（图3G）、GhNRT1.5（图3H）和GhNRT1.1（图3I）的表达水平下调。这表明GhCEPD1-4调节高氮侧根部的GhNRT2.1、GhNRT1.5和GhNRT1.1的表达。

3.3 环剥对棉花高氮侧根部硝酸盐吸收的影响
可能存在从地上部分到根部的信号传导，从而调节高氮侧根部的硝酸盐吸收。在高氮侧根部进行韧皮部环剥以评估其生理效应。结果显示，与非均匀氮处理棉花的高氮侧根部未环剥的韧皮部相比，环剥后的15N含量（图4A）和NO3?流速（图4B）分别减少了57.9%和45.4%。这表明韧皮部环剥显著降低了高氮侧根部的硝酸盐吸收。与非均匀氮处理棉花的高氮侧根部未环剥的韧皮部相比，环剥后的高氮侧根部GhNRT2.1-1（图4C）、GhNRT2.1-2（图4D）、GhNRT2.1-3（图4E）、GhNRT2.1-4（图4F）、GhNRT2.1-5（图4G）、GhNRT1.5（图4H）和GhNRT1.1（图4I）的表达水平下调。这表明韧皮部环剥降低了高氮侧根部与硝酸盐吸收相关的基因表达。在非均匀氮处理下，可能存在从地上部分到根部的信号传导（可能是GhCEPD1-4），促进高氮侧根部的硝酸盐吸收。

3.4 GhCEP-GhCEPD通路在非均匀氮条件下调节棉花的硝酸盐吸收和运输
野生型（WT）幼苗用含有3.75 mM或0.25 mM NO3?的营养液处理。随着处理时间的增加（0、3、6、9、12、24和48小时），低氮处理幼苗叶片中的GhCEPD1-4（图2A）和根部中的GhCEP6（图5A）表达水平显著高于对照组。这表明GhCEP6可能对低氮胁迫有特异性响应。此外，在非均匀氮处理下，低氮侧根部及叶片中的GhCEP6（图5B）和GhCEPD1-4（图2B）表达水平显著高于对照组。这些结果表明GhCEP6和GhCEPD1-4可能参与非均匀氮条件下棉花高氮侧根部的硝酸盐吸收。当向低氮侧根部添加GhCEP6肽时，高氮侧根部叶片中的GhCEPD1-4（图5C）和GhNRT2.1-1（图5D）、GhNRT1.5（图5E）和GhNRT1.1（图5F）表达水平显著高于未添加GhCEP6肽的对照组幼苗。这表明GhCEP6在高氮侧根部起重要作用。

3.5 环剥对棉花高氮侧根部硝酸盐吸收的影响
可能存在从地上部分到根部的信号传导，从而调节高氮侧根部的硝酸盐吸收。在高氮侧根部进行韧皮部环剥以评估其生理效应。结果显示，与非均匀氮处理棉花的高氮侧根部未环剥的韧皮部相比，环剥后的15N含量（图4A）和NO3?流速（图4B）分别减少了57.9%和45.4%。这表明韧皮部环剥显著降低了高氮侧根部的硝酸盐吸收。与非均匀氮处理棉花的高氮侧根部未环剥的韧皮部相比，环剥后的高氮侧根部GhNRT2.1-1（图4C）、GhNRT2.1-2（图4D）、GhNRT2.1-3（图4E）、GhNRT2.1-4（图4F）、GhNRT2.1-5（图4G）、GhNRT1.5（图4H）和GhNRT1.1（图4I）的表达水平下调。这表明韧皮部环剥降低了高氮侧根部与硝酸盐吸收相关的基因表达。在非均匀氮处理下，可能存在从地上部分到根部的信号传导（可能是GhCEPD1-4），促进高氮侧根部的硝酸盐吸收。

3.6 GhCEP-GhCEPD通路在非均匀氮条件下调节棉花的硝酸盐吸收和运输
野生型幼苗用含有3.75 mM或0.25 mM NO3?的营养液处理。随着处理时间的增加（0、3、6、9、12、24和48小时），低氮处理幼苗叶片中的GhCEPD1-4（图2A）和根部中的GhCEP6（图5A）表达水平显著高于对照组。这表明GhCEP6可能对低氮胁迫有特异性响应。此外，在非均匀氮处理下，低氮侧根部及叶片中的GhCEP6（图5B）和GhCEPD1-4（图2B）表达水平显著高于对照组。这些结果表明GhCEP6和GhCEPD1-4可能参与非均匀氮条件下棉花高氮侧根部的硝酸盐吸收。当向低氮侧根部添加GhCEP6肽时，高氮侧根部叶片中的GhCEPD1-4（图5C）和GhNRT2.1-1（图5D）、GhNRT1.5（图5E）和GhNRT1.1（图5F）表达水平显著高于未添加GhCEP6肽的对照组幼苗。这表明GhCEP6在高氮侧根部起重要作用。

4. 讨论
硝酸盐在植物中既是一种关键的营养物质，也是一种重要的信号分子（Wang等人，2018年）。植物通过硝酸盐感应、信号转导和调控过程来调节硝酸盐的吸收和运输，从而促进植物生长（Long等人，2021年；Wang等人，2018年）。土壤中硝酸盐的空间异质性是地理环境、土地灌溉和降雨之间复杂相互作用的结果（Long等人，2021年）。植物具有长距离信号调控途径，涉及AtCEP，在低硝酸盐条件下被诱导，并促进高硝酸盐侧根对硝酸盐的补偿性吸收（Ohkubo等人，2017年）。在本研究中，当棉花幼苗根部受到低硝酸盐溶液处理时，GhCEP6的表达上调。在拟南芥中，根源AtCEP肽会在叶片中产生特定的多肽CEPD，作为从茎到根的长距离信号传递，该信号传递到根系并上调高硝酸盐侧根中硝酸盐转运蛋白NRT2.1的表达，从而促进高硝酸盐侧根对硝酸盐的吸收（Ohkubo等人，2017年）。棉花主要吸收和利用硝酸盐，并具有较高的耐盐性，常种植在肥力差、养分分布不均的新开垦农田中，如盐碱地（Foley等人，2011年）。本研究发现，棉花的硝酸盐吸收调控机制与拟南芥相似，对于研究非均匀硝酸盐条件下作物的氮利用具有参考价值。在本实验中，随着低硝酸盐处理时间的延长，根部GhCEP6和叶片中GhCEPD1-4的表达水平呈上调趋势。通过比较棉花和拟南芥中六个GhCEPD基因的系统发育关系，发现棉花的GhCEPD1-4蛋白与拟南芥的CEPD1具有最高的同源性，达到86%。GhCEPD1-4基因启动子的转录因子结合位点预测显示存在MYB转录因子的结合位点，该转录因子可能被低硝酸盐诱导（Wang等人，2020年），进一步证明CEPD可以响应低硝酸盐胁迫。对嫁接棉花幼苗进行均匀低硝酸盐、均匀高硝酸盐和非均匀硝酸盐处理后发现，非均匀硝酸盐处理诱导了叶片中GhCEPD1-4基因的表达。在高硝酸盐侧根中，GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5基因的表达以及NO3?的流入速率和叶片15N含量均高于均匀硝酸盐处理的棉花幼苗。这表明GhCEPD1-4在非均匀硝酸盐条件下起着重要作用。GhCEPD1-4基因可能参与调节高硝酸盐侧根中的硝酸盐吸收。先前的研究表明，GhCEPD1-4基因是叶片特异性表达基因（Li等人，2024年）。对VIGS-GhCEPD1-4嫁接棉花幼苗进行非均匀硝酸盐处理后发现，沉默GhCEPD1-4基因会下调高硝酸盐侧根中GhNRT2.1、GhNRT1.1和GhNRT1.5的表达水平，显著降低根部的NO3?流入速率和叶片中的15N含量。这表明GhCEPD1-4可以调节根部GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5基因的表达，从而调节棉花幼苗的硝酸盐吸收能力。对接受非均匀硝酸盐处理的高硝酸盐侧根的韧皮部进行环剥后，高硝酸盐侧根中GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5基因的表达以及NO3?的流入速率显著下降。这表明根部的非均匀硝酸盐处理可以诱导叶片中GhCEPD1-4的表达。GhCEPD1-4肽可能通过韧皮部运输到根部，诱导GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5基因的表达，从而促进高硝酸盐侧根中的硝酸盐吸收。在非均匀硝酸盐处理下，棉花叶片中GhCEPD1-4的表达显著上调，而GhCEP6参与了其调控。拟南芥的CEP1在低氮条件下被诱导，CEP多肽可以通过根到茎的运输诱导CEPD1/2的表达（Ohkubo等人，2017年）。此外，在棉花根部盐分分布不均的情况下，GhCEP4的表达也上调（Li等人，2024年）。在本研究中，与非均匀硝酸盐处理后，低硝酸盐侧根中的GhCEP6表达显著上调。这是否意味着GhCEP6参与了GhCEPD1-4基因的表达调控？先前的研究发现，外源CEP的应用可以发挥其功能（Taylor等人，2025年；Wang等人，2025年）。棉花中GhCEP4多肽的合成可以促进低盐侧根中的硝酸盐吸收（Li等人，2024年）。在本研究中，外源应用GhCEP6多肽后，叶片中GhCEPD1-4的表达上调，高硝酸盐侧根中GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5的表达也上调，表明GhCEP6可以在GhCEPD1-4的上游发挥作用。我们分析了GhCEP6基因的启动子序列，发现其中包含与氮相关的顺式作用元件（AGTCA元件、GATABOX、TATABOX5、MYB2CONSENSUSAT；补充表S2），表明可能存在某些转录因子参与其功能调控。先前的研究发现，拟南芥中由低氮诱导的AtTCP20可以结合AtCEPs的启动子并参与调节AtCEPs基因的表达，从而影响拟南芥的系统性氮吸收过程（Chu等人，2021年）。豆科植物中的MtNIN结合并激活MtCEP7和MtCLE13以调节根瘤数量，MtCEP7启动子近端的一个NIN结合位点（NBS）对其共生激活是必需的（Laffont等人，2020年）。需要进一步研究以确定是否有新的转录因子负责在非均匀硝酸盐条件下调节GhCEP6的表达。总之，在根部受到低氮处理后，棉花叶片中GhCEPD1-4基因的表达上调。在非均匀硝酸盐处理下，低硝酸盐侧根诱导GhCEP6产生GhCEP6多肽，增加了叶片中GhCEPD1-4的表达。随后，GhCEPD1-4促进了高硝酸盐侧根中硝酸盐吸收相关基因GhNRT1.1、GhNRT2.1和GhNRT1.5的表达，从而促进硝酸盐吸收，满足棉花幼苗茎部的硝酸盐需求（图6）。