Euphorbia austroanatolica 和 E. rhytidosperma（大戟科）的进化关系与多样化：这两种植物是东地中海生物多样性热点地区——托罗斯山脉的特有物种

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Evolutionary relationships and diversification of Euphorbia austroanatolica and E. rhytidosperma (Euphorbiaceae), narrow endemics of the Taurus Mountains in the eastern Mediterranean biodiversity hotspot

　　汤姆·菲施巴赫（Tom Fischbach）|瓦伦丁·海默（Valentin Heimer）|博佐·弗拉伊曼（Bo?o Frajman）
因斯布鲁克大学植物学系，斯特恩瓦尔特斯特拉塞15号（Sternwartestra?e 15），6020因斯布鲁克，奥地利

**摘要**
安纳托利亚南部（土耳其）的托罗斯山脉是地中海生物多样性热点地区内的一个重要特有物种中心，然而该地区植物物种的多样化及其进化历史仍知之甚少。我们采用了一种综合方法，结合了双酶切限制性位点相关DNA测序、核ITS和质体ndhF–trnL序列数据、相对基因组大小（RGS）估计以及形态测量分析，来推断托罗斯特有物种Euphorbia austroanatolica和E. rhytidosperma的进化历史，并厘清它们与分布在地中海盆地不同区域的近缘物种之间的关系。分化时间估计表明，这种快速辐射可能是由晚中新世的干旱事件引发的；RGS数据则表明西地中海谱系的起源是多倍体。与早期假设相反，我们的结果清楚地表明，E. austroanatolica在遗传和形态上与东地中海的E. spinosa不同。系统基因组分析显示，E. rhytidosperma是E. austroanatolica的最近亲缘物种，而它们的最近亲缘关系属于E. verrucosa和E. clementei联盟。这两种托罗斯特有物种在中新世中期（约360万年前）开始分化，并经历了地理隔离和形态差异，这与其不同的生态偏好相符——E. austroanatolica栖息在干燥的蛇纹岩悬崖上，而E. rhytidosperma则生长在潮湿的岩石峡谷中。适应不同栖息地的过程伴随着显著的形态分化。我们的研究结果有助于更好地理解Euphorbia sect. Helioscopia成员之间的系统发育关系，并强调了托罗斯山脉及其多样的生境作为东地中海植物多样化关键中心的重要性。

**1. 引言**
作为25个生物多样性热点之一（Myers等人，2000年），地中海盆地拥有超过24,000种植物，其中60%为该地区特有（Greuter，1991年）。这一极高生物多样性的主要原因在于该地区多样的微气候、地形和土壤类型，这些因素源于复杂的地质和气候事件（Blondel等人，2010年）。高度结构化和斑块状的景观以及历史上的气候变化导致了许多植物物种的特有性和狭窄的分布范围（Médail和Diadema，2009年；Blondel等人，2010年；Nieto Feliner等人，2014年；Nieto Feliner等人，2023年；Frajman等人，2026年）。东地中海作为亚洲和欧洲的交汇处，被认为比西地中海拥有更丰富的物种多样性，并成为众多地中海谱系的发源地（Mansion等人，2009年；Nieto Feliner，2014年；Stevanoski等人，2020年）。希腊和土耳其拥有超过10,000种特有植物，因此常被称为“热点中的热点”（Noroozi等人，2019年；Türkmen，2019年；Kougioumoutzis等人，2021年）。

土耳其位于地中海、高加索和伊朗-安纳托利亚热点的交汇处（Mittermeier等人，2005年），跨越伊朗-图兰、环北极和地中海植物区系（Takhtajan，1986年），拥有约12,000种植物，其中32%为该国特有（Davis等人，1971年；Güner等人，2012年）。土耳其的主要特有物种中心是西南部的托罗斯山脉，该地区属于地中海生物多样性热点（Davis等人，1971年；Eren等人，2004年；Noroozi等人，2019年）。托罗斯山脉从海平面到高山带的异质生境以及北部和南部地区之间的强烈气候差异是该地区高特有性的主要原因（Noroozi等人，2019年）。

托罗斯山脉的两种特有物种是Euphorbia austroanatolica和E. rhytidosperma。根据形态特征，它们被归类为Euphorbia sect. Helioscopia，这是Euphorbia subgen. Esula下的21个分支中最大的一个（Riina等人，2013年）。这一亚属代表了Euphorbia在欧亚大陆的辐射演化，特别是在地中海和伊朗-图兰地区物种丰富（Riina等人，2013年），土耳其记录了约90种该亚属的物种（Radcliffe-Smith，1982年）。Euphorbia rhytidosperma是一种稀疏毛发的多年生植物，生长在安纳托利亚南部的岩石峡谷中（Radcliffe-Smith，1982年）。该物种早在两个世纪前就被描述过，最初被认为与西部的E. squamigera和东地中海的E. hierosolymitana有亲缘关系（Boissier，1859年；Radcliffe-Smith，1982年）。相反，E. austroanatolica则最近被归类为与东地中海的E. cassia有亲缘关系（Khan，1964年）。然而，系统基因组分析表明，E. austroanatolica实际上属于Euphorbia sect. Pithyusa（Riina等人，2013年）。Radcliffe-Smith（1982年）认为E. austroanatolica没有近缘物种，而Geltman（2008年）提出它与E. verrucosa联盟有密切关系。另一方面，Greuter等人（1986年）和Govaerts等人（2000年）认为E. austroanatolica与巴尔干地区的E. glabriflora是同种，后者最近根据系统发育和形态测量分析被归类为E. spinosa subsp. glabriflora（Stevanoski等人，2020年）。E. austroanatolica是一种细长、略带蓝绿色的多年生植物，高度可达25厘米，栖息在安纳托利亚西南部穆尔拉省的松树林和蛇纹岩及石灰岩悬崖上；E. rhytidosperma则更为粗壮，高度可达60厘米，生长在安纳托利亚东南部的梅尔辛和阿达纳省的钙质岩石峡谷中（Radcliffe-Smith，1982年；图1）。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料
根据《土耳其植物志》（Radcliffe-Smith，1982年），我们识别了E. austroanatolica和E. rhytidosperma，并在其分布范围内采集了样本；对于E. rhytidosperma，我们在Radcliffe-Smith（1982年）指定的区域西侧发现了额外的种群。遗传分析和RGS测量基于2024年收集的硅胶干燥叶片样本，形态测量分析则基于标本馆标本进行。此外，还有其他几种植物也被纳入系统发育分析（详见下文）。标本存放在IB，收集详情见表S1，其中还包含了参与具体分析的种群信息。研究种群的分布情况见图1。

2.2. 相对基因组大小测量
使用CyFlow空间流式细胞仪（Symex Partec，德国格罗利茨）对4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的细胞核进行流式细胞术（FCM），以估计硅胶干燥植物材料的RGS（Cresti等人，2019年）。我们使用Bellis perennis（2C = 3.38 pg；Sch?nswetter等人，2007年）作为内部参考标准。通过分析样本和参考标准的G1峰的变异系数（CV）来评估测量的可靠性。根据Suda和Trávní?ek（2006年的建议，CV > 7%的测量结果被舍弃）。我们估计了7个E. austroanatolica种群和5个E. rhytidosperma种群中每个个体的RGS。此外，我们还纳入了14个近缘物种的193个种群的RGS数据（部分数据已由Stevanoski等人（2020年）和Cakovi?等人（2021年）发表）。对于包含二倍体和四倍体种群的异倍体物种，我们仅纳入了二倍体种群。所有物种的RGS箱线图以及E. austroanatolica和E. rhytidosperma的散点图在R 4.5.1中生成（R Core Team，2025年）。我们使用Wilcoxon秩和检验来检测两种物种之间的RGS是否存在统计学显著差异。

2.3. DNA提取、ITS和质体测序及Sanger序列数据分析
在对所有可用的Euphorbia sect. Helioscopia ITS序列进行初步分析后（未展示），我们选择了与E. austroanatolica和E. rhytidosperma同属一个分支的所有物种样本，以及其他近缘分支的代表作为外群。总基因组DNA的提取、ITS扩增和测序按照Frajman和Sch?nswetter（2011年）的方法进行，质体ndhF–trnL区域的扩增和测序则按照Pahlevani和Frajman（2023年）的方法进行。我们对每个E. austroanatolica种群中的5个个体和每个E. rhytidosperma种群中的3个个体进行了测序。此外，我们还对16个近缘物种的18个样本进行了ITS测序，并添加了GenBank中的79个样本；对于ndhF–trnL，我们对29个物种的68个样本进行了测序，并添加了GenBank中的10个样本（详见表S1）。使用Geneious Pro 5.5.9（Kearse等人，2012年）对序列进行了组装、编辑和对齐。ITS序列中的碱基多态性使用NC-IUPAC模糊代码进行编码。质体比对中的插入缺失（indels）使用SeqState 1.25（Müller，2005年）以二进制字符表示，并应用了简单的插入缺失编码规则（Simmons和Ochoterena，2000年）。ITS和质体数据集的最大简约（MP）和MP自助法（MPB）分析使用PAUP 4.0b10（Swofford和Documentation，2002年）进行。通过1000次随机序列添加、TBR交换和MulTrees方法进行了启发式搜索，最多生成1000棵树（nchuck = 1000）。所有字符均等加权且无序处理。数据集使用完整启发式方法、1000次重复、TBR分支交换和随机序列添加进行了自助法分析，贝叶斯分析使用MrBayes 3.2.1（Ronquist等人，2012年），应用了Akaike信息准则提出的K2PG（ITS）和GTRG（质体数据）替换模型（MrAIC.pl 1.4，Nylander，2004年）。质体比对结果被分为核苷酸和插入缺失两组，插入缺失被视为形态数据（Lewis，2001年）。

2.4. RAD测序
根据Bayona-Vásquez（2019年的3RAD协议，使用XbaI和EcoRI-HF限制性内切酶对每个样本的100 ng DNA进行双酶切处理，制备了53个物种的RADseq文库。每个样本使用独特的EcoRI和XbaI接头进行索引。消化和接头连接同时进行，使用NheI作为第三种限制性内切酶以提高连接效率（Bayona-Vásquez等人，2019年）。样本混合后，使用SPRIselect磁珠（Beckman Coulter）对DNA片段进行470-600 bp的大小筛选，随后在Illumina iTru5和iTru7引物下进行14个PCR循环扩增。在Pippin Prep（Sage Science）上进行额外大小筛选，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer的高灵敏度DNA试剂盒进行质量评估，最后在VBCF（维也纳）的Illumina NovaSeq SP平台上进行150循环配对末端测序。我们使用了FastQC 0.11.8（Andrews等人，2010年）对原始Illumina读段进行质量评估，然后使用STACKS 2.62（Catchen等人，2013年）中实现的process_radtags.pl进行解复用，并使用TRIMMOMATIC 0.39（Bolger等人，2014年）进行质量修剪。原始序列读段可在NCBI的BioProject PRJNA1347071.2.5下获取。RADseq位点的从头组装和变异调用是使用STACKS中实现的denovo_map.pl完成的。从头组装的参数优化是在一部分样本上进行的，包括每个分类单元的一个个体。我们遵循了80%规则（Paris等人，2017年），仅保留至少在80%的个体中存在的位点，并探索了将堆栈合并为假定位点时允许的错配数量（M）的不同值，范围从0到8。对于每个M值，考虑为多个样本间同源的位点之间的最大差异数量（n）从n = M变化到n = M + 1，以考虑物种间的较高遗传差异（Paris等人，2017年）。形成堆栈所需的最小读段数量（m）保持在m = 3。最大化用于从头组装的位点数量的最优参数是m = 3，M = 5，n = 6。然后使用STACKS中实现的populations程序将数据导出为各种格式，具体取决于后续分析（见下一段）。经过质量过滤后，每个样本的平均原始读段数量为629万（标准差SD = 704万）。总共获得了662,249个位点和1,343,059个SNP。2.6 RADseq数据的系统发育分析系统发育关系是从IQ-TREE 2（Minh等人，2020年）中连接的RADseq数据推断出来的。使用populations程序将位点以VCF格式从STACKS目录中导出，并应用最大观察杂合度（maxHo）过滤器0.65来去除潜在的旁系物。我们进一步使用BCFtools 1.20（Danecek等人，2021年）仅保留最小基因型读取深度（DP）为5且最大DP为500的单核苷酸多态性（SNP）。我们探索了不同的过滤设置以评估系统发育推断的稳健性。总共构建了四棵基于至少在50%或70%的个体中存在的SNP的最大似然（ML）树，并且最小次要等位基因计数（MAC）为三个或没有MAC过滤器。过滤后的VCF文件使用vcf2phylip.py（https://github.com/edgardomortiz/vcf2phylip）转换为phylip格式，并在IQ-TREE 2中移除了不变位点。最后，在IQ-TREE 2中使用1000次超快自助法复制（Hoang等人，2018年）、确定性偏差校正和过高的节点支持校正（-bnni）从连接的数据集中构建了ML树，最佳替换模型由ModelFinder（Kalyaanamoorthy等人，2017年）自动确定。最佳评分树在FigTree 1.4.4（Rambaut，2018年）中可视化。所有从具有不同过滤设置的数据集中重建的树显示出大致一致的拓扑结构（未显示）。总体而言，基于在至少50%的个体中存在的30,624个SNP的树获得了最高的自助法支持（图4A），其中所有分支都得到了高度支持。此外，我们使用SplitsTree 6.3.27（Huson和Bryant，2024年）为E. austroanatolica、E. rhytidosperma及其密切相关的物种构建了一个NeighbourNet，使用adegenet（Jombart和Ahmed，2011年）计算的Nei距离，基于一个最多有50%缺失数据的数据集，包含54,759个SNP。使用贝叶斯物种树推断方法SNAPP 1.6.1（Bryant等人，2012年）在BEAST 2.7.4（Bouckaert等人，2019年）中估计了物种间的分化时间。在populations中生成了一个包含每个RAD位点一个SNP的数据集，maxHo = 0.65，并使用snapp_prep.rb（https://github.com/mmatschiner/snapp_prep）准备了一个没有缺失数据的输入XML文件，包含201个SNP。我们应用了二次校准来将包含E. illirica和E. angulata的分支与其余物种的分支之间的分裂年龄限制在11.99 Ma（Kravanja等人，2025年），使用正态先验和2.25 Ma的标准差。SNAPP分析进行了三次独立运行，每次运行2,000,000代，并每1,000代保存一棵树。在Tracer 1.7.2（Rambaut，2018年）中分析日志文件以评估收敛性，确保所有参数的有效样本量（EES）> 200。三次运行在LogCombiner 2.7.7中合并，丢弃了10%的树作为燃烧期，并在TreeAnnotator 2.7.6（Bouckaert等人，2019年）中构建了一个包括平均节点高度的最大分支可信度树，并在FigTree 1.4.4（Rambaut，2018年）中可视化。2.7 E. austroanatolica的形态测量分析对来自三个表型最发达种群的1到6个标本进行了形态测量分析，共计16个个体。此外，我们还检查了来自W标本馆的两个标本馆标本的5个个体，特别是关于果实特征（详见表S1）。对于E. rhytidosperma，检查了三个发育良好的种群，每个种群有2到4个个体；由于这些标本没有完全成熟的果实或种子，因此没有测量与这些器官相关的特征。共分析了42个特征（30个度量特征和12个比率；表S2）。宏观特征，如茎和某些叶子的属性，是使用尺子手动测量的。所有其他植物部分是使用Olympus SZX9立体显微镜拍摄的显微图像和图像分析软件Gryphax（Jenoptik）测量的。基于形态测量数据，我们为这两个物种编写了描述，其中度量值对应于第10和第90百分位数，并用括号表示极端值。E. rhytidosperma的果实和种子的描述来自Radcliffe-Smith（1982年）。此外，E. austroanatolica的22个营养和花序特征（表S2）以及E. spinosa s.l.（包括之前被认为是E. austroanatolica同种的E. glabriflora）的形态测量数据也被纳入统计分析，数据来自Stevanoski等人（2020年）。由于某些特征并非所有标本都存在，我们用同一分类单元的相应变量的平均值替换了缺失数据。统计分析使用SPSS 24.0进行。为所有特征生成了箱形图，以可视化E. austroanatolica和E. spinosa两个亚种之间的变异。使用Spearman相关系数测试了22个度量特征之间的相关性，并排除了六个特征对中相关系数>0.8的一个特征，即中间茎叶基部最宽部分的距离、小叶基部最宽部分的距离和小叶的长度。在标准化为零均值和单位方差后，进行了基于相关矩阵的主成分分析（PCA）和判别分析（DA）。3. 结果3.1 E. austroanatolica的相对基因组大小范围从0.536（种群3）到0.557（种群2），而E. rhytidosperma的相对基因组大小范围从0.486（种群5）到0.497（种群4；图2A，B）。E. verrucosa联盟的物种具有最相似的RGS，E. gasparrinii、E. montenegrina、E. serpentinii和E. verrucosa的RGS最低，范围从0.433到0.526，而E. flavicoma的RGS略高，为0.487–0.602（图2B）。E. acanthothamnos联盟（RGS 0.582–0.769）和E. spinosa（RGS 0.698–0.839）的相对基因组大小仅略高，而E. clementei联盟的RGS则高得多（1.164–1.227）。根据Wilcoxon秩和检验（W = 35；p = 0.003），E. austroanatolica和E. rhytidosperma之间的RGS差异显著。下载：下载高分辨率图像（182KB）下载：下载全尺寸图像图2. Euphorbia austroanatolica和E. rhytidosperma内的相对基因组大小（RGS）变化（A）以及与密切相关物种的关系（B）。A中的种群数量对应于表S1和图1。3.2 基于ITS和ndhF–trnL序列的系统发育关系使用贝叶斯和最大简约方法进行的系统发育重建得出了大致一致的拓扑结构。在ITS树（图3）中，E. austroanatolica的种群形成了一个得到强烈支持的支系（后验概率，PP，1，自助法支持值，BS，99%），在一个多分支中（PP 0.95）与（1）包含E. rhytidosperma（PP 0.98，BS 57%）和E. clementei联盟的物种（PP 0.62）的支系（PP 0.98，BS 57%），以及（2）由E. verrucosa联盟的物种组成的支系（PP 0.98，BS 60%）。包括上述所有物种的支系与E. spinosa（PP 1，BS 100%）和E. acanthothamnos联盟的物种（PP 1，BS 77%）在一个多分支中（PP 1，BS 80%）。下载：下载高分辨率图像（816KB）下载：下载全尺寸图像图3. 基于内部转录间隔区（ITS）序列的贝叶斯共识树显示了Euphorbia austroanatolica和E. rhytidosperma的系统发育位置。分支上方的数字是后验概率>0.50，分支下方的数字是最大简约自助法值>50%。种群数量对应于表S1和图1。ndhF–trnL树（图S1）中的关系解析度较低。大多数支系的PP和BS值较低。所有三个E. rhytidosperma的样本都嵌套在一个支持度较低的支系中（PP 0.89），其中包括E. verrucosa联盟的成员，内部关系未解决（多分支）。三个和两个E. austroanatolica的样本分别包含在两个支系中（PP 0.76；PP 0.99，BS 74%），与E. sect. Helioscopia的大多数其他物种的关系未解决。3.3 基于RADseq数据的系统发育关系在基于51,391个SNP的最佳评分最大似然树（图4A）中，E. austroanatolica是E. rhytidosperma的姐妹群（BS 100%），它们共同是包含E. acanthothamnos联盟（BS 100%）和一个包含E. spinosa（BS 100%）以及E. verrucosa联盟（BS 100%）的支系的姐妹群（BS 100%）。所有上述物种的姐妹群是西地中海的E. clementei联盟（BS 100%）。这种关系在NeighbourNet（图4B）中也得到了反映，其中E. austroanatolica和E. rhytidosperma与E. acanthothamnos和E. clementei联盟有共同的分支，而E. spinosa和E. verrucosa联盟则更为疏远。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图4. 基于RAD测序数据的系统发育关系显示了Euphorbia austroanatolica和E. rhytidosperma的位置及其与Euphorbia sect. Helioscopia的密切相关成员的关系。（A）基于30,624个SNP的最佳评分最大似然树；分支上方的数字表示自助法支持。种群数量对应于表S1和图1。（B）基于Nei距离的NeighbourNet，从54,759个SNP计算得出。（C）基于201个SNP的SNAPP估计的物种树。分支上方的数字是后验概率>0.6，分支下方的数字显示了相应节点的分化时间估计，水平条表示95%的最高后验密度（HPD）用于年龄估计。在SNAPP估计的物种树（图4C）中，E. austroanatolica和E. rhytidosperma位于一个起源于晚中新世5.6 Ma（最高后验密度，HPDs 3.1–8.7 Ma）的谱系中，它们的分化始于中更新世3.6 Ma（HPDs 1.7–5.9 Ma）。在同一谱系中（PP 0.91）还有两个包含E. clementei联盟（PP 1）和E. verrucosa联盟（PP 0.95）的支系。所有上述物种的姐妹群是E. spinosa（PP 1）和包含E. acanthothamnos联盟（PP 1）的支系。3.4 E. austroanatolica和E. spinosa之间的形态差异E. austroanatolica的形态特征状态，包括比率，在表S2中呈现。基于营养和花序特征的PCA散点图（前三个主成分分别解释了39.2%、18.9%和7.8%的总变异；图5）显示E. austroanatolica和E. spinosa s.l.在第一主成分上有明显的分离，但在第二主成分上两个亚种之间有重叠。对第一主成分贡献最大的特征是花序总苞的宽度、小叶的形状和形式（最宽部分与基部的距离/长度的比率；长度与宽度的比率），以及茎的长度。相应地，DA（第一轴解释了98.1%的变异；图5B）也显示了E. austroanatolica和E. spinosa在第一轴上的明显分离。对这种分离贡献最大的特征与PCA中的特征相同，除了茎的长度。下载：下载高分辨率图像（245KB）下载：下载全尺寸图像图5。**Euphorbia austroanatolica**与**E. spinosa**的形态学差异：(A) 主成分分析（PCA）和(B) 判别分析（DA）散点图。4. 讨论 4.1. **Euphorbia austroanatolica**与**E. rhytidosperma**的系统发育位置

关于**Euphorbia austroanatolica**和**E. rhytidosperma**亲缘关系的先前假设存在争议，这两种植物是亚洲小亚细亚托罗斯山脉的特有种。我们的系统发育分析表明，它们与亲缘关系更近的**E. hierosolymitana**、**E. squamigera**和**E. verrucosa**关系密切，但与**E. spinosa**的关系较远（Boissier, 1859; Khan, 1964; Radcliffe-Smith, 1982; Greuter et al., 1986; Govaerts et al., 2000; Geltman, 2008）。与所有先前的假设相反，基于RADseq数据的分析表明这两种植物关系最为密切，同时也与**E. acanthothamnos**、**E. clementei**和**E. verrucosa**有共同的祖先，这与一些先前的假设一致（Boissier, 1859; Geltman, 2008）。ITS数据（图3）显示**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**与**E. clementei**和**E. verrucosa**的关系最为密切，这一结果也得到了RADseq数据的SNAPP分析（图4C）的支持。这两种托罗斯山脉特有种的RGS值高度重叠（图2），进一步证实了它们与**E. verrucosa**的密切关系。另一方面，西地中海地区的**E. clementei**联盟物种的RGS值大约是前者的两倍，表明它们是四倍体（Rice et al., 2015及参考文献）。目前没有关于**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的染色体计数数据。此外，基于RADseq数据的NeighbourNet分析（图4B）表明**E. acanthothamnos**联盟也与**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**有共同的祖先，而**E. spinosa**则更为分化。不同RADseq数据分析方法得出的系统发育关系部分不一致可能是由于SNP的数量和组成不同所致，这种情况在其他植物群体中也很常见（例如，Wagner et al., 2020; Cai et al., 2021; Hühn et al., 2022; Stojilkovi? et al., 2022）。树状图中的短内部分支（图4A, C）和几乎呈星形的NeighbourNet（图4B）以及其中的中部冲突性分支表明主要谱系之间的分化迅速，这可能是导致观察到的矛盾信号的原因。除了不完全的谱系分选外，杂交及随后通过协同进化导致的ITS拷贝同质化（Alvarez and Wendel, 2003）也可能解释了RADseq和ITS推断的系统发育关系之间的不一致。尽管如此，我们的系统发育分析明确表明**E. austroanatolica**不能被视为**E. spinosa**亚种**glabriflora**的同义词（Greuter et al., 1986; Govaerts et al., 2000）。我们的形态学分析也支持这一观点，表明这两种植物之间存在明显差异（图5），它们的RGS值也不同（图2）。最后，质体数据（图S1）对**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的系统发育位置以及它们与其他**E. sect. Helioscopia**物种的关系没有提供明确结论。在最近演化的Euphorbia群体中，质体序列的低分化程度、核序列系统发育关系的不一致以及不同物种间质体单倍型的共享现象很常见（例如，Hand et al., 2015; Frajman and Sch?nswetter, 2017; Pahlevani and Frajman, 2023）。

除了揭示**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的进化起源外，我们对RADseq数据的最大似然分析（图4A）也证实了**E. acanthothamnos**相对于**E. bivonae**和**E. hierosolymitana**是并系的（Hand et al., 2015；此处也通过基于ITS的系统发育分析得到证实），这表明东地中海地区的**E. acanthothamnos**存在隐秘进化现象。此外，RADseq数据（图4A, B）还表明意大利特有种**E. gasparrinii**与地理上更远的西地中海物种**E. flavicoma**的关系比与邻近的**E. verrucosa**更密切，尽管这一结论没有bootstrap支持（Cresti et al., 2019）。RADseq数据（图4A, B）还表明巴尔干中部特有种**E. serpentinii**与广泛分布的西北部**E. verrucosa**关系更密切，而非东南部的**E. montenegrina**；而AFLP数据（Cakovi? et al., 2021）对这三者之间的关系没有明确结论，RADseq基础的SNAPP树（图4C）也是如此。

**Euphorbia austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的异域物种形成伴随着形态学和生态学的分化。上述大多数主要谱系/联盟，包括**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的共同祖先，起源于晚中新世（5.6–7.6 Ma）。这一时期全球气候向更季节性、更干燥和更凉爽的方向转变；亚热带生物群落逐渐被类似草原的草地取代，适应干旱的物种开始多样化（Tzanova et al., 2015），这一过程因墨西拿盐度危机（Lo Presti and Oberprieler, 2009）而加剧。然而，**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的分化始于中新世中期（3.6 Ma）。中新世期间（5.3–2.6 Ma），地球气候变得更凉爽、更干燥和更季节性（Suc, 1984, Lisiecki and Raymo, 2005, Suc and Popescu, 2005, Jiménez-Moreno et al., 2013）。与布鲁恩苏姆-罗伊弗转变（3.5 Ma）相关的全球降温导致了凉爽冬季的出现，从而在中新世晚期地中海地区森林逐渐消失，草地和蒿属草原扩散（Suc and Zagwijn, 1983, Suc et al., 1995）。在安纳托利亚南部，未适应日益干燥环境的物种在较高海拔的孤立森林避难所或适宜的微生境中存活（Jiménez-Moreno et al., 2015）。这些环境变化可能导致**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**共同祖先的分布范围分裂，随后发生异域物种形成。这种分化伴随着生态形态的分化。安纳托利亚具有高度的环境异质性和栖息地多样性（Noroozi et al., 2019），适应不同栖息地可能导致更明显的形态分化（Rundle and Nosil, 2005）。**E. austroanatolica**生长在干燥、裸露的悬崖和砾石地上，植被覆盖度低；而**E. rhytidosperma**则生长在更湿润的地带，如阴凉的河谷或植被茂密的森林中。与其他生长在蛇纹岩上的物种类似（例如，Cecchi et al., 2011, Gustafson et al., 2003），**E. austroanatolica**的分布范围仅约7平方公里，而**E. rhytidosperma**的分布范围要大得多；我们的野外工作在其已知分布范围以西发现了更多该物种的种群（Radcliffe-Smith, 1982）。尽管两者亲缘关系最密切，但由于形态差异显著（图6, 图7；参见下文物种描述），它们从未被视为近缘物种。这种强烈的形态差异可能是由于它们适应了截然不同的栖息环境所致。RGS的显著差异支持了这两种植物的明确分离，其中**E. austroanolica**的值略高。这与通常认为生长在蛇纹岩上的植物基因组较小的趋势相反（Pustahija et al., 2013）。同样，主要生长在蛇纹岩上的**E. serpentinii**和**E. spinosa**亚种**glabriflora**的RGS与不生长在蛇纹岩上的近缘物种没有显著差异（图2；Stevanoski et al., 2020）。

**总结**：我们的研究揭示了安纳托利亚南部特有种**E. austroanatolica**和**E. rhytidosperma**的共同起源及其随后的分化，突显了这一地区，特别是西托罗斯山脉作为土耳其植物特有性的主要中心。这与先前关于土耳其植物多样性和特有性的评估（Davis et al., 1971, Eren et al., 2004, Noroozi et al., 2019）以及强调东地中海地区尤其是安纳托利亚作为地中海盆地植物进化库的重要性的生物地理学研究一致（Mansion et al., 2009, Manafzadeh et al., 2017, Stojilkovi? et al., 2022）。然而，这一地中海生物多样性热点地区在当代系统发育研究中被忽视，我们希望我们的研究能激发对东地中海生物多样性的进一步深入探索。这一点非常重要且及时，因为预计地中海山区植物将面临气候变化引起的极端热浪和夏季干旱（Giménez-Benavides et al., 2017），加上该地区巨大的人为影响，使得分布狭窄的特有物种面临极高的灭绝风险。

**分类学处理**：
- **Euphorbia austroanatolica**：Hub.-Mor. & M.S. Khan.，《Notes Roy. Bot. Gard. Edinburgh》25: 99 (1964) ≡ Tithymalus austroanolicus (Hub.-Mor. & M.S.Khan) Soják，《?as. Nár. Mus., Odd. P?ír.》140: 170 (1972)。模式标本：[土耳其] “C2: Mu?la省K?yce?iz地区，Mu?la–Fethiye之间，Mu?la东南方向141公里处”，1938年6月，Huber-Morath 5281（正模标本Hb. Hub.-Mor.；副模标本E）。
- **描述**：多年生植物，茎高21–28(29)厘米，直径0.7–2.0(2.2)毫米，从木质基部生长。茎中部有1–37(51)根毛。中部叶片长椭圆形至倒披针形，长(0.9)1.2–3.2(3.5)厘米，宽(2.1)3.1–5.9(7.0)厘米，长度是宽度的(3.1)4.0–6.0(6.9)倍，基部渐狭至圆形，顶端尖锐至钝圆。叶缘不规则锯齿状，每2毫米有(2)5–26(34)根毛。叶片上表面中部有0–3(8)根毛，下表面中部有0–8(18)根毛。花序轴5条，偶尔4条，长(0.4)1.1–35.5(3.9)厘米，分枝2次，偶尔3次。花序轴上的小叶椭圆形至披针形，长(10.0)11.0–30.0(36.0)厘米，宽(2.6)3.3–7.8(8.5)厘米，长度是宽度的(1.7)2.3–5.2(6.1)倍，基部渐狭至圆形，顶端尖锐至钝圆。小叶宽卵形，长(3.8)4.8–13.7(14.9)厘米，宽(2.3)2.5–6.4(6.7)厘米，长度是宽度的(1.6)1.7–2.5(3.0)倍，基部狭圆，顶端尖锐。聚伞花序总苞钟形，长(1.8)2.2–4.3(4.7) × (2.5)2.7–4.5(5.9)毫米，宽(0.6)0.7–1.1(1.6)倍，具有弯曲的椭圆形腺体，长(0.8)0.9–1.8(3.0) × (1.1)1.2–2.1(2.2)毫米，宽(0.5)0.5–1.2(2.1)倍。蒴果近球形，浅三裂，长(3.2)3.4–4.8(5.0) × (2.3)3.2–4.2(4.5)毫米，宽(0.8)0.9–1.5(2.2)倍，基部宽(1.3)1.4–2.1(2.3)厘米，具疣状突起(0.3)0.5–1.0(1.1) × (0.6)0.6–0.9(1.0)毫米，长度是宽度的(0.5)0.7–1.3(1.4)倍。种子卵形至椭圆形，光滑，棕色，长(1.8)2.0–2.3(2.3) × (1.2)1.3–1.6(1.6)毫米，长度是宽度的(1.4)1.4–1.6(1.7)倍，基部宽(0.25)0.30–0.48(0.56)倍。冠毛肾形或半球形，长0.3–0.4 × 0.4–0.6毫米，宽度是长度的0.5–0.9倍。
- **分布**：安纳托利亚西南部的西托罗斯山脉（土耳其）。
- **保护状况**：根据IUCN (2012)标准D/D2，属于易危（VU）。

- **Euphorbia rhytidosperma**：Boiss. & Balansa，《Diagn. Pl. Orient. Sér.》2 3 (4): 84–85 (1859)。模式标本：[土耳其] “Gorge de Guzel Dere，位于Sedichig上游，Mersina以北3里处（奇里乞亚）”，1855年6月，B. Balansa 272（G！），Geltman (2008)指定为正模标本。副模标本：P！
- **描述**：多年生植物，茎长35–46(48)厘米，直径(1.4)1.6–2.7(3.0)毫米，从木质基部生长。茎中部有0–2(3)根毛。中部叶片长椭圆形至披针形，长(3.1–5.0) × (0.3–1.0)厘米，宽(2.6)3.3–16.4(17.0)倍，基部渐狭至圆形，顶端尖锐至钝圆。叶缘不规则锯齿状，每2毫米有(13)17–26(29)根毛。叶片表面覆盖着细毛，叶片上表面中部每2毫米有2-3至8根毛，下表面中部每2毫米有4-15（24）根毛。主脉数量为5条，长度为（2.3）4.1-8.4（9.3）厘米，分枝2至3次。侧生叶呈披针形至三角形，尺寸为（1.4）2.0-4.9（6.3）×（0.7）0.9-2.0厘米，长度是宽度的（1.6）1.9-3.3（3.5）倍，最宽处位于叶片长度的（0.15）0.21-0.35（0.44）处；叶基部逐渐变细或呈圆形，顶端尖锐或钝圆。更小的侧生叶呈宽卵形至三角形，尺寸为（8.1）11.2-19.1（20.5）×（7.2）7.9-19.3（22.1）毫米，长度是宽度的0.9-1.5（1.6）倍，最宽处位于叶片长度的（0.14）0.21-0.46（0.53）处；叶基部略呈圆形，顶端尖锐。聚伞花序的总苞呈钟形，尺寸为（2.4）2.4-3.2（3.5）×（2.8）2.9-4.1（4.5）毫米，长度是宽度的0.6-1.1（1.3）倍；总苞上分布着椭圆形的腺体，尺寸为（0.8）0.9-1.2（1.3）×（1.4）1.8毫米，长度是宽度的0.5-0.7倍。果实直径为3毫米，表面有少量疣状突起。种子直径为2毫米，呈棕色，表面具有网状皱褶。图6、图7。
**分布范围：** 土耳其南部安纳托利亚地区，介于德姆雷（Demre）和阿达纳（Adana）之间。
**生境：** 河谷及森林中的湿润至中等湿度环境。
**保护状况：** 根据IUCN（2012年）标准，该物种被列为“易危”（VU）。

**作者贡献声明：**
Tom Fischbach：负责撰写、审稿与编辑工作，原始稿件的撰写，研究方法的设计，资金筹集，数据分析及数据管理。
Valentin Heimer：负责撰写、审稿与编辑工作，数据可视化处理，研究方法的设计，项目监督，资金筹集及概念框架的构建。
**资金支持：** Tom Fischbach的野外研究工作得到了因斯布鲁克大学（国际关系办公室）提供的KWA奖学金资助。