温度升高对Phanaeus vindex蜣螂（金龟子亚科）次级种子传播的影响

《Current Research in Insect Science》：Impacts of warmer temperatures on secondary seed dispersal by Phanaeus vindex dung beetles (Scarabaeinae)

　　内森·杜尔 | 金伯利·S·谢尔顿
田纳西大学生态与进化生物学系，诺克斯维尔，TN 37996

**摘要**
气候变化影响物种间的相互作用，并对生态系统功能产生连锁效应，包括种子传播。研究表明，在气候变化的影响下，食果动物的行为及其相关的种子传播方式会发生变化。然而，关于非食果动物（如次级种子传播者）因气候变化而产生的行为变化如何影响种子命运，目前知之甚少。蜣螂是许多生态系统中的重要次级种子传播者，因为它们会将含有种子的粪便埋藏起来，作为成虫的食物储存或用于繁殖的育婴球。我们利用迷你温室进行野外实验，研究了温度升高对美国田纳西州一种掘洞蜣螂（Phanaeus vindex）种子传播行为的影响。以玻璃珠作为种子的替代品，我们发现食物储存中的珠子数量更多，且埋藏深度比育婴球更浅。这表明，在以往的研究中很大程度上被忽视的食物储存可能在植物招募过程中起着关键作用。在迷你温室的温暖条件下，我们发现蜣螂将食物储存埋得比对照组更深，但无论处理方式如何，食物储存所经历的温度相似。对于育婴球，我们没有发现埋藏深度或所经历温度的差异。在温暖条件下，食物储存中种子的更深埋藏可能会对发芽和出苗产生不利影响，但也可能保护种子库中的种子免受地表温度升高的不利影响。我们得出结论，气候变化可以改变次级种子传播者的行为，从而影响植物-动物相互作用，进而影响植物招募、群落结构和生态系统功能。

**引言**
预计气候变化会改变物种间的相互作用及其相关的生态系统功能，而这些功能对于维持健康的生态系统至关重要（Pe?uelas和Filella，2001；Visser和Both，2005；Hill等人，2021；?kesson等人，2021）。部分原因是物种相互作用的结果取决于具体环境条件，并可能因不同非生物因素而变化（Chamberlain等人，2014）。随着物种对气候变化的不同反应，它们的行为、表型、种群规模和地理分布的变化也会改变物种间的相互作用。这些变化可能导致隐性的功能丧失，即某个物种提供的生态系统功能消失，而该物种本身并未从环境中消失（McConkey和O’Farrill，2015）。因此，了解物种对气候变化的反应将如何影响物种间相互作用对于预测未来的生态系统功能至关重要（Walther，2010；Strydom等人，2021；Grünzweig等人，2022）。

动物介导的种子传播是生态系统中的一个关键功能，这一过程可能因气候变化而受到干扰，而这些干扰可能因传播者的行为变化而加剧或缓解（Harmon和Barton，2013；McConkey和O’Farrill，2016；Sales等人，2021）。超过一半的植物依赖动物进行种子传播，这些生态相互作用决定了植物种群动态、群落结构以及从干扰中的恢复（Howe和Smallwood，1982；Jordano，2000；McConkey等人，2012；Beckman和Sullivan，2023）。对于动物而言，行为变化通常是对外部变化的最初反应，但这些变化会对种子传播产生影响（McConkey和O’Farrill，2016综述）。目前，我们对气候变化导致的温度升高如何影响种子传播行为了解有限（McConkey和O’Farrill，2016；Donoso等人，2022）。以往的研究主要集中在食果动物对气候变化的反应上，但次级种子传播者的行为仍然是一个研究不足但重要的方面（Vander Wall等人，2005；Beckman和Sullivan，2023；Nogales等人，2024）。

蜣螂是许多生态系统中的重要次级种子传播者（Nichols等人，2008；Torabian等人，2024），它们的行为对气候变化非常敏感（Kirkpatrick和Sheldon，2022；Mamantov和Sheldon，2021）。掘洞蜣螂会找到脊椎动物的粪便来源，然后收集粪便并将其埋藏在地下，形成用于繁殖的育婴球或用于成虫进食的食物储存。由于脊椎动物的粪便中通常含有种子，这些种子可以被移离原始粪便来源，并在地下通过蜣螂的活动得到二次传播。这种次级种子传播有助于种子逃避种子捕食者和病原体的影响（Estrada和Coates-Estrada，1991；Chambers和MacMahon，1994）。此外，种子埋藏可以为种子的成功发芽和生长提供更适宜的环境（Chambers和MacMahon，1994；Shepherd和Chapman，1998）。尽管关于蜣螂次级种子传播的生态重要性已有大量研究，但大多数研究集中在热带地区，而在温带北美的相关研究却严重不足（Nichols等人，2008；Andresen和Urrea-Galeano，2022）。

气候变化引起的蜣螂行为变化可能会影响次级种子传播。温度升高会影响蜣螂的行为，进而影响其提供的生态系统服务，如养分循环和生物扰动（Slade和Roslin，2016；Holly和Andrew，2018；Holly和Andrew，2020；Gotcha等人，2022）。例如，已有研究表明，某些蜣螂物种在温暖条件下会改变其繁殖行为，育婴球的埋藏深度会增加（Mamantov和Sheldon，2021；Kirkpatrick和Sheldon，2022）。在未来的气候条件下，种子埋藏深度和地下温度的差异可能会显著影响种子的存活率（Toy和Willingham，1966；Benvenuti等人，2001；Nyachiro等人，2002；Yang等人，2003）。这表明蜣螂筑巢行为的改变可能会影响次级种子传播，但这一点尚未得到研究。此外，关于蜣螂食物储存的文献相对较少（例如，Hanski和Cambefort，1991），目前尚不清楚温度升高是否以及如何影响食物储存行为。每种粪便类型在整体次级种子传播中的相对重要性也尚未被研究。

在这项研究中，我们通过野外实验研究了温度升高如何影响美国田纳西州蜣螂物种Phanaeus vindex的次级种子传播行为。为了测量种子移动情况，我们使用玻璃珠作为种子的替代品。我们的研究有三个目标：首先，确定哪种粪便类型（即食物储存或育婴球）包含更多的种子；其次，测量育婴球和食物储存的埋藏深度，以了解粪便类型如何影响种子传播；最后，测试温度升高如何影响埋藏的珠子数量和两种粪便类型的埋藏深度。我们的研究揭示了温度升高导致的行行为变化对次级种子传播的影响，进一步探讨了未来气候条件可能如何影响植物-动物相互作用和生态系统功能。

**材料与方法**
**研究物种**
我们选择了掘洞蜣螂Phanaeus vindex Macleay, 1819（又称彩虹金龟），这是一种中等大小的甲虫（雌性平均体长：17.35毫米），原产于美国东部（Wassmer和Armstrong，2023）。Phanaeus vindex通过建造精心构造的育婴球（圆形且包裹在保护性黏土壳中）来投资亲代抚育，而食物储存则是松散堆积在隧道中的粪便。因此，P. vindex的食物储存在外观上与育婴球有所不同（Price和May，2009）。该物种可以在人工饲养条件下容易繁殖，且在我们研究地点附近可以可靠地找到个体。

**甲虫采集**
2023年4月至7月期间，我们在田纳西州科达克的Seven Islands State Park的公共草地上（35°57’10.9° N, 83°41’15.9° W）采集P. vindex甲虫。我们使用装有牛粪的陷阱来捕捉甲虫。按照Kirkpatrick和Sheldon（2022）的方法，将雄性和雌性甲虫分别饲养在人工群体中，直到雌性受精并准备好进行野外实验。

**实验试验**
2023年6月至8月期间，我们在田纳西州东部的牧场进行十次实验。每次实验中，按照Kirkpatrick和Sheldon（2022）的方法，放置六个7加仑的桶（高度50厘米×顶部直径31厘米×底部直径26厘米），间距1米。我们在每个桶的底部切四个直径5厘米的孔以便雨水排出，并在桶底放置金属网以防止甲虫逃跑。我们将桶埋入地面，并用周围的土壤回填，尽量压实土壤，使桶内的土壤与周围土壤齐平。每个桶内的土壤深度为44厘米，顶部留有6厘米的空间用于放置牛粪。我们在每个桶内放置四个HOBO数据记录仪（型号：UA-001-64，Onset，Bourne，MA），分别设置在1厘米、15厘米、29厘米和43厘米深处，每30分钟记录一次温度。

实验开始时，我们从群体中取出雌性甲虫并记录其体重，然后随机将一只雌性甲虫分配到实验桶中。由于受精后的雌性可以储存精液并独立创建和埋藏食物储存和育婴球，因此每个桶中放置一只雌性甲虫。我们在桶底放置粪便和珠子的混合物。作为种子的替代品，我们使用了三种直径的玻璃珠（Luckkila品牌种子珠，直径分别为2毫米、3毫米和4毫米）。选择这些珠子大小是因为它们代表了P. vindex在当地哺乳动物粪便中可能遇到的种子大小（例如，Callicarpa americana的种子约2毫米，Rhus typhina的种子约3毫米，Sassafras albidium的种子约4毫米）（Beeman和Pelton，1980；Eagle和Pelton，1983；TN种子标本馆，2024）。我们称量每种珠子重量为2克（总共6克），然后将这些珠子与50克牛粪混合后提供给甲虫。接着，我们在每个桶的顶部覆盖金属网和金属格栅，以防止甲虫逃跑，并防止非实验动物干扰粪便。一半的桶覆盖了迷你温室，根据我们的数据记录仪，这些温室可使地表温度被动升高2.1°C（图S1），这与之前的研究方法一致（Kirkpatrick和Sheldon，2022）。另一半桶没有温室，作为对照组。每只雌性甲虫都被赋予唯一的编号，由于捕获的雌性甲虫数量有限，有些甲虫被重复使用两次，一次在对照组桶中，一次在温室桶中。

在实验期间，每3天清除一次桶表面的未使用粪便/珠子混合物，并提供新的混合物。甲虫在下次进食前从未完全移除所有粪便/珠子混合物。9天实验期结束后，我们手动挖掘每个桶中的粪便沉积物并记录其埋藏深度。我们将每个粪便沉积物带回实验室，通过打开它们来确定其类型（食物储存或育婴球）。然后我们将粪便沉积物放入60°C的干燥箱中24小时，之后记录其重量。为了从粪便沉积物中回收珠子，我们将干燥后的沉积物放入流水下过滤。对于每个粪便沉积物，我们记录每种珠子的数量和重量。并非所有种子在埋藏过程中都留在粪便中，因此有些种子可能位于隧道内但不在粪便沉积物中。然而，由于需要使用7加仑的桶来捕捉P. vindex的埋藏行为，因此在实地筛选整个土壤柱中的珠子、将土壤保存以供后续处理或为每次试验使用新土壤是不可行的。因此，我们没有记录在土壤柱中发现的散落珠子。尽管这限制了我们检查整个次级种子传播的能力，但我们的研究仍然允许我们比较不同粪便沉积类型和温度条件下的次级种子传播行为。在我们的研究中，埋藏行为仅限于实验桶的直径范围内（上直径：31厘米，下直径：26厘米）。一些粪金龟物种在自然界中会挖掘对角线隧道，但P. vindex倾向于直接在粪便源下方挖掘。我们将粪便放置在桶的中心，因此我们观察到的大多数隧道从未到达桶壁。此外，Fincher（1973）的研究发现，P. vindex甲虫在沙质粘壤土坑（宽度、长度和高度均为1.8米）中埋藏的育虫球深度为5-40厘米，平均深度为25厘米。Ritcher（1945）也指出，P. vindex甲虫埋藏的育虫球深度为20.3-25.4厘米。这些育虫球的深度与我们在研究中观察到的结果相当，表明桶并没有干扰埋藏行为。

统计分析
首先，我们检查了哪种粪便沉积类型含有更多的珠子，以及温度升高是否影响了埋藏的珠子数量。为此，我们分析了温室和对照桶中所有埋藏的粪便沉积物数据，包括那些不含珠子的粪便沉积物。我们使用每克埋藏粪便中的珠子质量来进行标准化处理，然后对这些数据应用平方根转换以使分布标准化。我们在R语言中拟合了一个随机截距线性混合效应模型（LME，R版本4.5.1），响应变量是每克粪便中的珠子质量的平方根。我们包括了粪便沉积类型（育虫球或食物储存）、桶类型（温室或对照）以及粪便沉积类型和桶类型之间的交互作用作为固定效应。由于一些甲虫被多次试验，大多数甲虫在每次试验中埋藏了多个粪便沉积物，因此我们还包括了试验次数和雌性识别（给每个雌性分配的唯一代码）作为随机效应。我们将每个模型的加权赤池信息量准则（wAIC）得分与具有相同随机效应结构的零模型进行了比较。对于最终模型，我们提供了边际R平方值（R2m）（R包MuMIn）和固定效应的效果大小。

接下来，我们研究了粪便沉积物的埋藏深度，以及P. vindex雌性是否会在温度升高时改变其埋藏行为。为了进行分析，我们拟合了一个随机截距LME模型，响应变量是粪便沉积物的埋藏深度的自然对数，固定效应包括粪便沉积类型和桶类型，以及粪便沉积类型和桶类型之间的交互作用，还有试验次数和雌性识别作为随机效应。

最后，我们检查了含珠粪便沉积物所经历的温度，以及这些温度是否因粪便沉积类型和桶类型而异。为了估计每个粪便沉积物所经历的温度，我们遵循Kirkpatrick和Sheldon（2022）的方法，使用四个埋藏温度记录器的数据来拟合一个线性模型，该模型将试验期间记录的平均温度作为埋藏深度的函数（见图S1）。我们利用这种关系来估计所有十次试验中每个粪便沉积物所经历的平均温度。然后我们拟合了一个LME模型，响应变量是粪便沉积物的平均估计温度，固定效应包括粪便沉积类型、桶类型以及粪便沉积类型和桶类型之间的交互作用，还有试验次数和雌性识别作为随机效应。

在十次试验中，35只Phanaeus vindex雌性创建并埋藏了199个粪便沉积物，其中101个是育虫球（50个来自温室桶，51个来自对照桶），98个是食物储存（47个来自温室桶，51个来自对照桶）。在这199个粪便沉积物中，98%（即195个）含有珠子。不含珠子的粪便沉积物包括3个育虫球和1个食物储存，全部来自温室桶。在含珠的粪便沉积物中，115个（59%）包含了每种大小的珠子。甲虫获得了等量的每种大小的珠子，且甲虫以相似的质量埋藏了所有三种大小的珠子（见图S2）。

我们检查了不同类型粪便沉积物中含有的珠子数量，以及温度升高是否影响了埋藏的珠子数量。我们发现含珠的育虫球（n=98）和食物储存（n=97）的数量几乎相等。然而，P. vindex埋藏的食物储存每克粪便中的总珠子质量比育虫球更多（见图1a）。平均而言，食物储存中的每种大小的珠子数量也更多（2毫米：11.10个，3毫米：5.30个，4毫米：2.00个），而育虫球则较少（2毫米：9.75个，3毫米：3.47个，4毫米：0.95个）（见图S3）。用于分析每克粪便中埋藏珠子质量的模型包括了粪便沉积类型和桶类型的固定效应及其交互作用（βfood_cache = 0.09，βgreenhouse = -0.01，βfood_cache x greenhouse = 0.03，wAIC = 1，R2m = 0.31）。温度升高或温度处理与粪便沉积类型之间的交互作用对每克粪便中埋藏珠子质量的影响可以忽略不计（见图2）。

接下来，我们研究了粪便沉积物的埋藏深度，以及P. vindex雌性是否会在温度升高时改变其埋藏行为。在温室中，土壤表面下1厘米处的平均温度（30.0°C）高于对照桶（27.9°C）（见图S1）。用于粪便沉积物埋藏深度的模型包括了粪便沉积类型和桶类型的固定效应及其交互作用（βfood_cache = -0.46，βgreenhouse = 0.00，βfood_cache x greenhouse = 0.19，wAIC = 1，R2m = 0.23）。无论桶类型如何，食物储存的埋藏深度都比育虫球更浅（食物储存深度：平均值=14.2厘米，标准差=7.5厘米；育虫球深度：平均值=23.0厘米，标准差=8.0厘米）（见图1b）。然而，对温度升高的行为反应因粪便沉积类型而异；在温室中，食物储存的埋藏深度更深（15.7 ± 7.5厘米），而在对照桶中则较浅（12.8 ± 7.3厘米）（见图3a），但育虫球在温室中的埋藏深度与对照桶相似（23.3 ± 7.7厘米 vs 22.6 ± 8.2厘米）（见图3a，b）。

根据埋藏温度记录器的记录，我们发现温室和对照桶中的食物储存和育虫球所经历的平均估计温度没有差异（食物储存平均温度：温室=27.3°C，对照=27.4°C；育虫球平均温度：温室=26.6°C，对照=26.8°C）（见图3c，d）。用于粪便沉积物温度的模型包括了粪便沉积类型和桶类型的固定效应及其交互作用（βfood_cache = 0.34，βgreenhouse = -0.24，βfood_cache x greenhouse = 0.27，wAIC = 0.75，R2m = 0.02）。

讨论
我们的总体目标是研究温度升高如何影响Phanaeus vindex粪金龟的次级种子传播行为。为此，我们比较了食物储存和育虫球埋藏行为在次级种子传播中的作用，并研究了温度升高如何影响这些粪便沉积物中的种子埋藏。使用玻璃珠作为种子的替代品，我们发现几乎所有P. vindex的粪便沉积物都含有珠子。此外，食物储存中的珠子数量更多，且埋藏深度比育虫球更浅。在温室桶的较温暖条件下，P. vindex将食物储存埋得比对照桶更深，但食物储存在地下的平均温度在两种桶类型中相似。相比之下，育虫球在温室和对照桶中的埋藏深度相似，但这些育虫球在地下的温度也相似。

粪金龟的食物储存行为可能比筑巢行为对植物招募更有益。许多植物物种的种子在土壤深度1-5厘米处具有最佳的发芽和出苗条件，在5-10厘米处条件次优但仍然可行，在超过10厘米处则不可行（Rokich等人，2000；Benvenuti等人，2001；Burmeier等人，2010；Guo等人，2010；Limón和Peco，2016）。在P. vindex中，三分之一的含珠食物储存位于种子的可行深度（即距土壤表面10厘米），但所有育虫球都位于不可行的深度（即距土壤表面超过10厘米）（见图S4）。然而，粪金龟的挖掘可以将埋藏的种子移动到更浅的深度（Andresen和Urrea-Galeano，2022），从而使得土壤更加通透，使幼苗能够从更深的层次突破土壤层（Bang等人，2005）。一些本地植物甚至可能从深埋中受益，例如寄生植物Conopholis americana，它需要与宿主树的根接触才能发芽（Baird和Riopel，1986）。此外，育虫球中的种子存活可能会受到甲虫幼虫的负面影响，因为它们的咀嚼口器可能会损坏种子，以及围绕育虫球构建的保护性粘土壳可能会阻止发芽（Hata和Edmonds，1983）。由于食物储存比育虫球位于更浅的位置，因此可能有更多的种子出现，这表明食物储存可能对植物招募更有益。

由于成年甲虫的行为，一些粪便沉积物中的种子数量比其他沉积物更多。在食物储存过程中，成年甲虫将粪便移至地下以供以后食用（Hanski和Cambefort，1991），但如果需要，它们可以返回地面获取更多食物（Price和May，2009）。相比之下，育虫球中的食物是发育中的幼虫的唯一食物来源。在创建育虫球的过程中，成年甲虫会消耗能量过滤掉大颗粒的粪便，降低粪便的碳氮比，从而提高后代的营养价值（Andresen和Feer，2005；Holter和Scholtz，2007；Byrne等人，2013）。这些最大化后代营养的行为也会导致种子从育虫球中移除，这可能解释了为什么食物储存中的珠子数量更多。然而，食物储存中较高的种子密度也可能导致种子死亡率增加。未来的研究需要检查种子发芽和植物建立与食物储存和育虫球的关系，以确定哪种粪便沉积类型对植物招募最有益。

粪金龟食物储存行为的行为可塑性可以补偿较高的地表温度，保护种子免受气候变化带来的不利影响。温度升高会降低种子活力并加快发芽速度（Luna等人，2019），可能导致互利相互作用中的物候不匹配（Renner和Zohner，2018）。随着地表温度的升高，P. vindex将食物储存埋得更深，有效地缓冲了相关的种子温度影响。然而，尽管在对照组和温室组中，育苗球都被埋在相似的深度，但育苗球所经历的温度在不同类型的桶中也是相似的。因此，相对较深的埋藏深度足以有效保护育苗球及其所含的种子和幼虫免受较高地表温度的影响。虽然较深的种子埋藏深度可能会在短期内减少幼苗的出土数量，但可能会提高种子在种子库中的长期存活率。温度是导致种子休眠解除的关键因素，随着全球气温的持续上升，种子可能会因在不适当的时间发芽而增加死亡率（参见Ooi, 2012）。然而，较深的埋藏深度可以保护种子免受较高地表温度的影响，并提高种子在种子库中的长期存活能力（Dwyer和Erickson, 2016; Ma?ková和Poschlod, 2022）。目前，我们对植物在温度升高时因种子埋藏深度变化而产生的适应性权衡知之甚少。未来的研究需要探讨种子埋藏深度的变化如何影响休眠、发芽和出土情况，以了解在温暖条件下物种相互作用的变化所带来的影响。尽管二次种子传播被认为是植物招募阶段的重要环节，但仍有许多工作需要完成，以理解其中涉及的复杂物种相互作用以及这些相互作用将如何受到气候变化的影响（Forget和Wenny, 2005; Vander Wall等人, 2005; Beckman和Sullivan, 2023; Nogales等人, 2024）。更高的温度正在影响全球的生态系统，某些生态系统功能正以不可预测和隐蔽的方式受到影响（McConkey和O’Farrill, 2016, 2015）。尽管未来的气候变化情景可能与我们的温室实验有所不同，而且蜣螂在控制较少的环境中可能会表现出不同的行为，但我们的结果表明，蜣螂会通过调整某些埋藏行为来应对温度变化。因此，我们的研究说明了气候变化改变了植物与动物之间的相互作用，这对快速变化的世界中的生态系统功能、植物招募和群落结构有着重要影响。

**声明**
**资助**
本研究由美国国家科学基金会（资助编号2046368）和田纳西大学Herbarium Breedlove的Dennis基金资助。

**伦理批准**
不适用。

**参与同意**
不适用。

**出版同意**
不适用。

**数据和材料的可用性**
数据将在发表后通过Dryad数字存储库提供，网址为：10.5061/dryad.n02v6wx7s。在同行评审期间，可以通过以下URL访问数据文件：http://datadryad.org/share/MyvrjjQynZ2HKAn34OgJESLv4tq36-gtXNYJX9ey-_c。

**代码可用性**
本分析中使用的所有代码均可在R包中公开获取。

**作者贡献**
ND和KSS共同构思了这项研究，设计了研究方法并获得了资金支持。ND负责收集和分析数据并撰写了手稿。两位作者都对草稿进行了重要贡献，并最终批准了出版。

**未引用的参考文献**
Coleman等人，2015；deCastro-Arrazola等人，2020；Fleming等人，2021；Griffiths等人，2016；Halffter和Edmonds，1983；Klok和Harrison，2013；Koike等人，2012；Macagno等人，2018；Nervo等人，2014；Piccini等人，2018；Schupp等人，2010；Staab等人，2023；Scholtz等人，2009；Tseng等人，2018；Woodward等人，2005