南极半岛沿岸海水和沉积物中的抗生素抗性基因

《Marine Pollution Bulletin》：Antibiotic resistance genes in seawater and sediments along the Antarctic Peninsula

　　加布里埃尔·罗斯卡莱斯（Gabriel Roscales）|努里亚·马奎兹-普乔尔（Núria Marquez-Puchol）|康克西塔·阿维拉（Conxita Avila）|埃利森达·巴列斯特（Elisenda Ballesté）
巴塞罗那大学生物学院遗传学、微生物学与统计学系，西班牙巴塞罗那Diagonal 643号，邮编E-08028

**摘要**
抗生素抗性基因（ARGs）的传播对公共卫生和生态系统稳定性构成了重大威胁。海洋环境作为ARGs的自然储存库，接收来自野生动物和人类的排放物，从而影响其持久性和传播。由于人类活动的影响较小，南极洲成为研究“抗生素出现前”抗性组以及人类活动对抗菌素抗性影响的宝贵模型。本研究调查了blaTEM、sul1和tetW基因以及微生物种群（16S rRNA）在南极半岛17个站点（62°S–67°S）的丰度和分布情况。通过qPCR分析了海水及海洋沉积物中的细菌DNA，并将其与地理位置和深度相关联。16S rRNA基因测序还用于评估粪便污染的存在。ARGs的绝对丰度范围为每升海水2.1至3.3 log GC，每克沉积物2.1至3.3 log GC。相对丰度（log ARG/16S）范围为?5.3至?6.7。这些数值代表了海水和沉积物样本中的平均范围。tetW在所有水样中均被检测到，而sul1在所有沉积物中均被检测到，表明其分布具有矩阵特异性。在受人类活动影响的区域，ARGs的丰度高出四个数量级。在科学基地附近检测到粪便污染，表明废水排放可能是ARGs的潜在来源。这些结果为南极海洋ARGs提供了定量基准，突显了极地系统对局部人类和野生动物影响的敏感性，并将南大洋定位为ARG监测的哨兵环境。

**1. 引言**
抗菌素抗性（AMR）是全球公共卫生的主要威胁，2021年直接导致约114万人死亡，并与另外471万人的死亡相关（GBD 2021 Antimicrobial Resistance Collaborators, 2024）。人们对环境中AMR的关注日益增加，这源于其自然起源的证据（Dcosta等人，2011年），以及自然栖息地（如动物、河流、海洋和土壤）作为抗生素抗性基因（ARGs）储存库的作用（Marti等人，2014年；Miller等人，2009年；Pruden等人，2012年；Yuan等人，2019年）。尽管抗性可能作为微生物生存策略自然产生（Martínez，2008年），但人类活动显著加速了其传播。ARGs和耐抗生素细菌（ARB）可通过污水和废物进入生态系统（Makkaew等人，2021年），作为污染物并通过水平基因转移将抗性传递给本地细菌（Hatosy和Martiny，2015年）。此外，径流中的抗生素残留物可以筛选出环境中已存在的耐药微生物，进一步促进AMR的持久性和传播（Hatosy和Martiny，2015年）。已在污水处理厂（Pazda等人，2019年）、水产养殖场废水（Su等人，2020年）以及医院和住宅废水（Rodriguez-Mozaz等人，2015年）的排放物中检测到ARGs的存在，这些废水最终进入海洋环境。一项研究表明，粪便污染与这些水体中ARGs的丰度之间存在强正相关，表明废水排放是水生环境中ARGs的主要来源（Karkman等人，2019年）。然而，关于ARGs如何在水中和海洋沉积物中持续存在、传播和维持，目前知之甚少。海水和沉积物在ARG研究中的关注度较低，部分原因是这些稀释且动态的系统难以研究，其中化合物的快速扩散可能降低选择压力（Allison，2005年）。

尽管南极洲不是公认的AMR热点地区，但它仍然是监测ARGs最少的区域之一。其孤立且受影响较小的生态系统为研究“抗生素出现前”抗性组以及评估人类活动对ARGs和ARB传播的影响提供了宝贵模型（Scott等人，2020年）。尽管南极洲环境极端，但近几十年来人类活动有所增加（Hwengwere等人，2022年），这主要是由于旅游业的扩张（2023/2024季节游客超过8万人次）（国际南极旅游运营商协会，无日期）以及约100个研究站的存在（Brooks等人，2019年）。这些活动将非本地ARGs和ARB引入了当地环境，包括土壤、湖泊、冰川、雪、海水和废水（Bisaccia等人，2025年；Caruso等人，2024年；Hernández等人，2019年；Na等人，2019年；Ren等人，2024年；Szopińska等人，2022年；Wu等人，2025年），并且在罗瑟拉站（Rothera Station）等研究基地附近有粪便污染的证据（Hughes和Thompson，2004年）。此外，多种长距离迁徙的动物，如信天翁、海豹和贼鸥，将南极洲作为栖息地。例如，南极贼鸥会迁徙到受人类影响的地区，如印度洋或非洲之角，在那里它们可能获得与人类相关的ARB，并将其带回南极洲，成为传播媒介（Segawa等人，2024年）。因此，为了分析迁徙野生动物的作用及其与人类的相互作用，并理解人类活动对AMR传播的日益增长的影响，南极洲也是一个有价值的模型（Gutiérrez等人，2024年）。

尽管对抗生素抗性危机及其在海洋中的作用越来越关注，但目前仍缺乏关于水柱和海洋沉积物中自然抗性组以及人类影响的了解。我们通过定量PCR（qPCR）分析了南大洋水体和沉积物中三种广泛分布的ARGs（磺胺类 - sul1、β-内酰胺类 - blaTEM和四环素类 - tetW）的存在和丰度。选择这三种基因符合国际抗菌素抗性监测的建议，它们被公认为是环境AMR污染的可靠指标（Berendonk等人，2015年）。它们在极地研究中的高检出频率进一步支持了其重要性，超过80%的相关研究都对其进行了调查，且在超过50%的案例中被检测到。此外，由于磺胺类是合成化合物，对其的抗性常被用作原始环境中人类影响的指标（Bisaccia等人，2025年）。此外，还通过16S扩增子分析评估了粪便污染情况。具体目标包括：i) 确定这些基因在水柱和沉积物中的丰度和流行率，并建立该地区这些ARGs的基准水平；ii) 比较水柱层和沉积物之间的ARG分布，考虑到这两种环境之间的微生物生物量差异；iii) 分析不同地点之间的ARG差异，试图确定其与潜在的人类或动物影响是否存在关联；iv) 通过16S扩增子分析评估研究地点的粪便污染情况。

我们假设由于南极洲的孤立性和极低的人类活动，该地区的自然ARG基线是全球最低的之一。这些条件使其成为识别环境影响的理想场所。作为一项关键的创新贡献，本研究基于迄今为止最广泛的采样活动，建立了南大洋海水和沉积物中ARGs的丰度基准。通过将ARG量化与粪便污染标志物相结合，我们证明了局部ARG峰值可以与废水或野生动物输入相关联，为检测海洋环境中的点源污染提供了敏感的框架。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样本采集**
样本是在CHALLENGE项目下的两次考察中采集的。第一次是在2022年1月至3月期间在利文斯顿岛（南设得兰群岛）进行的本地考察，使用气垫船在五个地点采集了表层海水样本（图1）。选择这些地点时考虑了对野生动物和人类活动的可能影响。一个地点位于胡安·卡洛斯一世基地（BAE）的处理污水排放口附近，两个地点靠近汉娜角（HAN）和米尔斯崖（MIE）的鸟类筑巢区，另一个地点位于约翰逊冰川（JON）前方，还有一个位于南湾（BAY）。每个地点每天采集三个独立样本（表S1）。每个样本的1升海水通过0.22微米纤维素酯膜（SO-PAK，Millipore，德国达姆施塔特）过滤后储存于-80°C。

**2.2. DNA提取**
水样中的DNA使用DNeasy PowerBiofilm Kit（Qiagen）从3微米和/或0.22微米过滤器中提取，并包含对照组。纬度考察中的过滤器分别处理，但由于未发现基因丰度的显著差异，后来合并处理。海洋沉积物样本中的DNA使用DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen）从250毫克湿沉积物中提取。

**2.3. 实时定量PCR分析总16S rRNA基因和抗生素抗性基因**
ARGs sul1、tetW和blaTEM在20微升反应体系中扩增（StepOne Real-Time PCR，Applied Biosystems），sul1和tetW使用10微升TaqMan Environmental Master Mix 2.0，blaTEM使用10微升TaqPath。引物/探针如表S3所示，DNA模板量为5微升。循环条件为95°C 10分钟，随后是40个循环：95°C 15秒和60°C 1分钟。检测限（拷贝/反应）分别为sul1 10，tetW 1，blaTEM 10。16S rRNA基因使用引物341F/534R在20微升反应体系中扩增，其中包含10微升PowerUp SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆，MA），每种引物200纳摩尔，以及1微升DNA模板。循环条件与之前相同。所有样本、对照组和提取/过滤空白样本均重复处理两次。对技术重复实验中结果不一致的样本进行了重新测试。2.4. 环境基因（ARGs）的统计和数据分析qPCR结果基于三个标准进行了验证：效率在80%到120%之间，r2值≥0.99，以及阴性对照的Cq值低于灵敏度阈值。基因拷贝数是根据来自10倍系列稀释的自定义gBlock片段（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，美国）的五个点计算得出的，每次运行都重复两次。结果以每升海水中的对数基因拷贝数（log GC/L）或每克干海底沉积物中的对数基因拷贝数（log GC/g）表示，称为绝对丰度。通过将ARGs的绝对丰度标准化到16S rRNA基因来计算其相对丰度，并表示为ARG GC/单位与16S GC/单位的对数比率（单位=水为L，沉积物为g）。数据分析使用RStudio v1.4.4.0（RStudio，Inc.，波士顿，美国）进行。对于符合正态性和同方差性假设的数据，应用了带Tukey事后检验的单因素方差分析（p < 0.05），否则使用Kruskal-Wallis和Dunn检验。绝对和相对丰度都在不同区域和深度上进行了分析。然后使用ARG丰度作为响应变量，位置和深度作为分类预测因子，16S rRNA基因作为连续预测因子，拟合了一个多元线性回归模型。通过方差分析评估模型的显著性和预测因子的贡献，并对残差进行了正态性（Shapiro-Wilk）和同方差性（Breusch-Pagan）检验。2.5. 16S rRNA基因扩增子测序共选择了57个样本进行测序，包括来自本地监测活动的15个海水样本，来自纬度横断面的22个海水样本（排除了MB和RA站点，由于技术原因未进行测序），以及来自纬度横断面的20个沉积物样本（排除了YA、NE、RA和CC站点，同样由于技术原因）。这些样本被送往Novogene GmbH（慕尼黑，德国），在那里进行了所有下游分子程序。具体来说，Novogene使用修改版的通用引物515F - GTGYCAGCMGCCGCGGTAA（Parada等人，2016）和806R - GGACTACNVGGGTWTCTAAT（Apprill等人，2015）对16S rRNA基因的V4高变区进行了PCR扩增，随后进行了完整的文库制备。测序在Illumina MiSeq平台上进行，使用2 × 250 bp的配对末端读取（Illumina，Inc.，圣地亚哥，美国），每个样本生成大约30,000个配对末端读取。数据可在Mendeley Data公共仓库获取（doi:10.17632/6h5862vdy2.1）。2.6. 生物信息学分析原始的Illumina读取数据使用QIIME2（版本2024.10）（Bolyen等人，2019）的标准流程进行处理。使用DADA2插件（Callahan等人，2016）对配对末端读取进行了去噪。这一步包括适配器修剪、质量过滤、嵌合体去除和去重复，从而得到高分辨率的扩增子序列变异体（ASVs）。使用classify-sklearn插件（Pedregosa等人，2011）对代表性ASVs进行了分类，该插件应用了在SILVA v138参考数据库上训练的朴素贝叶斯分类器，相似度为99%（Bokulich等人，2018）。该分类器与scikit-learn版本1.4.2兼容，并针对16S rRNA基因的V4高变区进行了优化。被识别为叶绿体、线粒体、真核生物或未分类到界级的ASVs被排除在下游分析之外，以保留只有高置信度的细菌序列。经过这一初步处理后，生成了一个代表整个细菌群落的分类表。根据先前的研究，使用16S rRNA基因扩增子测序结合QIIME2等分析流程已成功用于检测粪便污染（Ahmed等人，2015）。这里选择的具体属是基于关于人类和动物肠道微生物组的文献以及经典的粪便指示菌（Bernhard和Field，2000；Holcomb和Stewart，2020；Rinninella等人，2019）。为了评估粪便污染，数据集随后被过滤，只保留包含至少两种以下粪便指示菌的样本：Escherichia、Enterococcus和Bacteroides（经典的人类粪便指示菌），Clostridium、Streptococcus、Fusobacterium、Lactobacillus、Prevotella、Ruminococcus和Bifidobacterium（在人类和其他温血动物中常见，并曾被用作指示菌）。这种过滤策略通过确保只有包含多种指示菌的样本被考虑用于粪便污染评估来减少假阳性。用于此过程的完整代码在GitHub上公开，以便透明度和可重复性（https://github.com/GROSCALES/QIIME2-FAECAL）。为了确保样本间的可比性，完整的群落表和粪便指示菌表都被简化到最低的测序深度（15,621个ASVs）。后续分析和可视化在RStudio软件v1.4.4.0中使用qiime2R（Bisanz，2018）和phyloseq包（McMurdie和Holmes，2013）进行。2.7. 采样站点的映射和潜在影响因素在ArcGIS Pro（Esri，Redlands，CA，美国）中生成了两种类型的专题地图：一种显示采样站点位置，另一种将这些站点与潜在影响源相关联——科学研究站、海上交通和野生动物高密度区域。所有地图都使用了SCAR南极数字数据库v7.10（Gerrish等人，2024）和英国南极调查基础地图（ArcGIS，无日期）的高分辨率底图。为了评估每个站点的环境影响，添加了三个专题图层：（1）基于2015年1月至2021年2月每约550米网格单元报告的AIS（自动识别系统）位置的全球船舶交通密度，数值越高表示活动越频繁（Cerdeiro等人，2020；世界银行，无日期）；（2）来自国家南极计划管理者委员会（Council of Managers of National Antarctic Programs，无日期）的南极研究设施的位置，包括到最近站点的距离；以及（3）野生动物分布，用符号表示动物高密度区域（Harris等人，2011；南极条约，1959）。3. 结果3.1. 环境基因丰度的定量和统计评估在海水样本中，ARGs的分布在这次利文斯顿岛和纬度横断面活动之间显示出相似的模式。tetW基因是最常检测到的，存在于所有样本中（分别为15/15和27/27）。关于sul1和blaTEM，在利文斯顿岛（分别在12/15和4/15个样本中检测到），它们的流行率在纬度横断面活动中有所不同：sul1的检测率下降到5/27，而blaTEM增加到14/27。所有分析基因的绝对丰度通常在2.00到6.00 log GC/L之间，平均值分别为2.87 ± 0.89（sul1）、2.42 ± 0.91（tetW）和2.54 ± 0.71（blaTEM）（图3A–B和表S4–5）。平均16S rRNA基因载量为8.34 ± 0.63 log GC/L（图S1A–B和表S4–5）。下载：下载高分辨率图像（339KB）下载：下载全尺寸图像图3. 不同采样日期（1、2和3）五个本地采样位置的海水中sul1、tetW和blaTEM的绝对丰度（log (GC/L或g）A），B）纬度采样三个深度（表面：SU，深叶绿素最大值：DCM，底部：DP）的九个站点的水中，以及C）纬度采样四个深度（0、5、10和20厘米）的九个站点的核心沉积物中。未进行基因量化的样本未显示。关于相对丰度（标准化到16S rRNA基因拷贝数），利文斯顿岛的值在?6.94到?2.92之间，而在纬度横断面上则在?7.19到?4.48之间。总体而言，平均相对丰度分别为?5.75 ± 0.90（sul1）、?6.01 ± 0.80（tetW）和?5.99 ± 0.58（blaTEM）（图4A–B）。下载：下载高分辨率图像（338KB）下载：下载全尺寸图像图4. 三个采样日期（1、2和3）五个本地采样位置的水中sul1、tetW和blaTEM的相对丰度A），B）纬度采样九个站点的三个深度（表面：SU，深叶绿素最大值：DCM，底部：DP）的水中样本，以及C）九个站点的四个沉积物深度（0、5、10和20厘米）的海洋沉积物样本中。相对丰度显示为ARG GC/单位与16S GC/单位的对数比率（单位=水为L，沉积物为g）。对海水中tetW的统计分析揭示了显著的空间异质性。在利文斯顿岛，绝对tetW水平（2.05到6.15 log GC/L）将Juan Carlos I基地（BAE）确定为显著热点（p < 0.05），其浓度比South Bay（BAY）、Hannah Point（HAN）和Miers Bluff（MIE）高出四个数量级。重要的是，这种显著的空间变异也在相对丰度中观察到，BAE的相对丰度显著高于BAY和HAN。多元回归确认站点是独立于总细菌丰度的显著预测因子。相反，在纬度横断面上，深度是主要驱动因素。尽管在Esperanza Bay（ES-SU）和Fildes Peninsula（FI-SU）出现了绝对热点——其值比其他站点高出两个数量级——但回归表明深度而非站点预测了丰度（p < 0.05）。具体来说，与深叶绿素最大值（DCM）相比，表层水中的相对tetW丰度显著增加。在沉积物样本中，sul1普遍存在（35/35个样本），而tetW（17/35）和blaTEM（13/35）则不然。sul1和blaTEM的平均绝对丰度较高（约3.3 log GC/g），而tetW为2.18 ± 0.35 log GC/g（图3C和表S4），16S rRNA的范围为7.89到9.65 log GC/g（图S1C和表S5）。就相对丰度而言，sul1的范围为?6.24到?4.17，而tetW和blaTEM的最小值分别为?7.34和?6.02。总体平均相对丰度分别为?5.56 ± 0.56（sul1）、?6.71 ± 0.46（tetW）和?5.30 ± 0.60（blaTEM）（图4C）。对沉积物的统计评估主要集中在sul1上。绝对丰度在不同站点间有显著差异（p < 0.001），Avian Island（AI）、Port Foster（DE）和Marguerite Bay（RO）的载量高于Byers Peninsula（BY）、Cierva Cove（CC）或Nelson Island（NE）。有趣的是，虽然相对sul1丰度在站点间没有总体差异，但深度有显著影响：较深的层次（10–20厘米）的每个细菌中的sul1比例显著高于表面。模型确认站点和尤其是深度是显著因素。基于最高的绝对或相对丰度，BAE、ES-SU和FI-SU（海水）以及AI、DE和RO（沉积物）被定义为热点并选为进一步研究。3.2. 潜在影响的映射可能导致观察到的热点（图5）的环境因素包括靠近科学基地、动物区域和海上交通。BAE站点距离Juan Carlos I基地的废水出口仅29米（最多50人），位于高海上交通区，有超过40,000条AIS记录（图5D和E）。ES站点距离Esperanza（90人）和Ruperto Elichiribehety（8人）基地约4公里，也显示出高海上影响，有超过30,000条AIS记录（图5G）。DE站点距离Gabriel de Castilla 600米，距离Deception基地1公里（两者最多36人），Deception Island有高达50,000条AIS记录（图5A）。RO站点距离Rothera站11公里，距离Dirck Gerritsz实验室10公里（10人），海上交通较低，峰值约为10,000条AIS记录（图5B）。下载：下载高分辨率图像（595KB）下载：下载全尺寸图像图5. 南极地区对ARGs潜在影响的来源。受ARG影响的采样站点用标有站点名称的绿色矩形表示。动物存在区域用候鸟符号表示。CONMAP层中的科学基地用圆圈表示：红色代表季节性基地，蓝色代表全年基地，圆圈大小与人口峰值成正比。显示了2015年至2021年的海上交通，船舶密度用从黄色到红色的颜色渐变表示。交通值表示研究期间每个网格单元中所有船舶记录的AIS（自动识别系统）位置报告的总数；该指标反映了船舶活动的总体强度，而不是独特船舶的数量。距离线表示每个采样站点到其最近影响源的最短路径（米）。A–G面板显示以下区域：A）Deception Island，B）Marguerite Bay，C）Avian Island，D）Juan Carlos I Base（BAE）周围，E）BAE和South Bay（BAY），F）Fildes Peninsula的Penguin Island，G）Esperanza Bay。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）FI站点距离Penguin Island 900米，这里是9种鸟类和4种海洋哺乳动物的家园，包括大约2500对Pygoscelis adeliae和7500对Pygoscelis antarctica。该站点也面临高海上交通，超过50,000条AIS记录（图5F）。AI站点距离Avian Island 1500米，是一个重要的鸟类站点，有7种鸟类和大约3500对Pygoscelis adeliae，以及海洋哺乳动物。这里的海上交通量较低，AIS记录的最高峰为10,000条（图5C）。3.3 基于16S rRNA基因的粪便污染评估分析显示，在37个海水样本中，只有4个样本含有多种与粪便相关的菌属，表明粪便菌属的多样性较高。这些样本来自Esperanza Bay（ES-SU）、Fildes Peninsula的海面水域，以及Juan Carlos I基地的第2天和第3天的样本（BAE2、BAE3）（图6）。检测到的菌属包括：Alloprevotella、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Escherichia-Shigella、Lachnoclostridium、Ligilactobacillus、Macellibacteroides、Parabacteroides、Paraprevotella、Prevotella、Ruminococcus和Streptococcus。下载：下载高分辨率图片（365KB）下载：下载全尺寸图片图6. 四个海水样本中与粪便相关的菌属的分类分布和相对丰度：Juan Carlos I基地（第2天和第3天，BAE2和BAE3）、Esperanza Bay（ES-SU）和Fildes Peninsula（FI-SU）的海面水域。粪便指示菌属包括Alloprevotella、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Escherichia-Shigella、Lachnoclostridium、Ligilactobacillus、Macellibacteroides、Parabacteroides、Paraprevotella、Prevotella、Ruminococcus和Streptococcus。BAE3的粪便菌属多样性最高，FI-SU最低。Prevotella和Bacteroides是最丰富的菌属，但在FI-SU中Bifidobacterium占主导地位。值得注意的是，Escherichia-Shigella仅在BAE3中被检测到，这是人类粪便污染的强烈指示物。将稀释后的粪便ASVs与总ASVs进行比较（表1），BAE3的比例最高（15.6%），BAE2较低（1.57%），ES-SU为0.54%，FI-SU最低（0.03%）。表1. 稀释前后海水和沉积物样本中与粪便相关的ASVs的丰度。该表显示了原始数据集（Total ASVs）和稀释数据集（Total rarefied ASVs）中ASVs的总数、粪便ASVs的数量以及粪便ASVs的相对丰度。采样地点：Avian Island – 20厘米（AI-20）、Port Lockroy – 10厘米（PL-10）和20厘米（PL-20）、Marguerite Bay – 0厘米（RO-0）、5厘米（RO-5）和20厘米（RO-20）、Esperanza Bay – 海面（ES-SU）、Fildes Peninsula – 海面（FI-SU）以及Juan Carlos I基地（第2天和第3天，BAE2和BAE3）。样本矩阵总ASVs粪便ASVs粪便相对丰度稀释后的粪便ASVs稀释后的总ASVs稀释后的粪便相对丰度（rarefy）AI-20沉积物23,9161180.00497415,6210.0047PL-10沉积物23,803200.00081015,6210.0006PL-20沉积物28,977220.00081015,6210.0006RO-0沉积物29,519160.0005615,6210.0004RO-20沉积物15,621140.00091415,6210.0009RO-5沉积物28,706310.00111115,6210.0007ES-SU海水55,2092900.00528215,6210.0053FI-SU海水44,838130.0003515,6210.0003BAE2海水28,4324470.015726915,6210.0172BAE3海水31,92649750.1558234215,6210.1499在20个沉积物样本中，只有6个样本含有超过两种与粪便相关的菌属：Avian Island – 20厘米（AI-20）、Port Lockroy – 10厘米和20厘米（PL-10、PL-20），以及Marguerite Bay – 0厘米、5厘米和20厘米（RO-0、RO-5、RO-20）。其中4个样本（RO-0、RO-5、PL-10、AI-20）仅含有Clostridia类（Ruminoclostridium和Clostridium sensu stricto_1）。PL-20和RO-20还分别含有约10%的Lactobacillus和Prevotella。沉积物中稀释后的粪便ASVs的比例均低于0.1%，除了AI-20，其比例超过了0.5%。4. 讨论海洋是抗生素抗性基因（ARGs）的重要储存库（Hatosy和Martiny，2015），南大洋的ARGs多样性很高（Zhang等人，2022）。特别是极地研究指出，在南极和北极水域中，90%的AMR研究调查了四环素抗性（阳性检出率为74%），其次是β-内酰胺抗性（69%），磺胺类抗性（56%）（Bisaccia等人，2025）。除了水生环境外，这些抗性因子也在南极土壤、粪便和湖泊沉积物中被发现（Hernández等人，2012；Jara等人，2020；Na等人，2019；Rabbia等人，2016）。然而，南大洋海洋沉积物和水柱中ARGs的存在和垂直分布尚未得到充分研究。本研究首次提供了62°至67°S范围内水和沉积物中sul1、tetW和blaTEM的丰度和分布数据，为原始环境建立了基准。我们还分析了它们的垂直和地理分布，并评估了潜在的影响因素，包括研究站、海上交通、野生动物和粪便污染。这些发现为未来的监测提供了框架，并有助于更好地理解这些ARGs在这个偏远海洋区域的传播和持久性。- 建立基准：极地环境中ARGs的相对丰度本研究在水和沉积物中发现的ARGs的平均绝对丰度和相对丰度为研究海洋环境中的ARGs提供了有价值的基准。对于水样，这些结果与原始北极水域的报告范围大体一致（Bonanno Ferraro等人，2024）。对于sul1，两个数据集的平均绝对丰度都在3.2–3.4 log GC/L之间，四环素抗性基因的丰度也在2.2–2.4 log GC/L范围内。这两个基因的相对丰度相差不到0.5 log。对于blaTEM，我们的绝对值大约高一个数量级；然而，经过16S rRNA基因标准化后，两个研究的结果接近?6 log，这表明差异反映了微生物生物量的不同。相比之下，受人类活动影响地区的数据显示出显著更高的ARG水平。太平洋和南大洋的浓度（Jang等人，2022）比本研究的测量值高出一个到三个数量级。同样，在英吉利海峡和北海，sul1的丰度据报道比本研究高出四个数量级（Bourdonnais等人，2022）。这种显著增加归因于在受人类活动影响区域进行采样。这种对比证实了这里观察到的低丰度水平确实代表了原始环境的基准参考。本研究的结果是首个基于qPCR的南极海洋沉积物基准数据。与原始北极沉积物（Marquez-Puchol等人，无日期）相比，所有基因的绝对丰度都在同一数量级范围内——例如，sul1约为2.6–3.3 log GC/g，tetW约为2.1–2.3 log GC/g——相对丰度相差不到一个对数单位。在北极进行的其他研究（Kong等人，2025）报告的ARG浓度显著更高。这一区别进一步证实了我们的数据作为未受污染极地环境的可靠基准。- tetW和sul1的矩阵依赖性分布和生态驱动因素本研究的主要发现之一是，tetW和sul1基因的分布取决于分析的基质，tetW在水中的丰度较高，而sul1在沉积物中较高。之前在南极半岛，特别是在Fildes地区进行的研究发现，四环素抗性在海水、淡水和废水环境中最为普遍（Hernández等人，2019；Rabbia等人，2016；Zhang等人，2022）。tetW的高频率可能与历史上在人类医学、水产养殖和畜牧业中使用四环素有关（Bisaccia等人，2025）。关于sul1基因，尽管在南极海洋沉积物中没有先前的记录，但其高丰度与北极海洋沉积物中的发现一致，在所有样本中都检测到了该基因且丰度很高（Kong等人，2025）。事实上，这项研究强调sul1是极地沉积物抗性组的核心组成部分，表明该基因即使在偏远的高纬度地区也具有很高的持久性和积累能力。此外，由于磺胺类和三甲氧苄氨嘧啶是合成分子，它们抗性基因的广泛存在是人为影响的有力证据（Bisaccia等人，2025）。这两个基因的一个关键区别是，sul1位于1类整合子的保守3′区域，这使得它能够在多种细菌宿主之间高效转移（Mazel，2006）。这一特性也使得sul1更容易受到其他抗生素和污染物（如重金属）的共同选择（Gupta等人，2022）的影响。因此，沉积物环境——细菌密度和污染物积累更大的地方——有利于sul1的持久性和积累。相比之下，tetW与移动遗传元件（特别是接合转座子）相关（Roberts，2005），似乎在水中传播得更有效。- 影响因素：研究站、海上交通和野生动物对ARG传播的作用尽管由于样本量和环境复杂性，统计稳健性存在局限性，但我们的结果揭示了水环境中tetW和沉积物中sul1的分布模式。位置和深度在塑造这些模式中起着关键作用，与总细菌丰度无关。局部“热点”的存在表明抗性基因负荷较高，但总细菌生物量并未相应增加。ARGs的相对丰度和绝对丰度之间的一致性表明，它们的水平并非简单地由微生物生物量的波动决定。相反，这种一致性表明这些基因的持续存在可能是由环境压力维持的，使ARGs在微生物群落中保持稳定比例。这表明抗性可能是由特定的人为或动物压力驱动的（Yang等人，2022）。深度也是垂直剖面中的一个区分因素：在水柱中，tetW的相对丰度在表面较高，可能反映了最近的输入或表面选择压力（D?elalija等人，2024）；在沉积物中，sul1的相对比例在较深层次增加，表明在较不活跃和受保护更好的微环境中存在持久性或积累过程。这种模式与细菌丰度相反，后者随深度增加而减少（Zhang等人，2021）。在我们的研究中，我们确定了六个ARG热点，可以根据其主要影响源进行分类。其中四个地点似乎受人类活动驱动：两个在水域（BAE和ES），两个在沉积物中（DE和RO）。其余两个热点（FI和AI）可能受野生动物影响。这主要是由于科学基地的邻近及其随之而来的废水排放。直到20世纪60年代南极条约建立之前，南极大陆的废水排放没有受到监管（Aronson等人，2011；Smith和Riddle，2009）。因此，任何先前的人类活动都影响了该地区。目前，废水规定要求只有居住人数超过30人的研究基地才需要在排放前处理废水（南极条约，1959）。然而，即使在这些情况下，所采用的处理方法也非常有限。这些方法主要侧重于通过沉淀池或过滤去除悬浮固体（Aronson等人，2011）。这些处理的局限性已在多项研究中得到证实。Fildes Peninsula基地的废水和周围海水中存在ARGs（Hernández等人，2019；Rabbia等人，2016；Szopińska等人，2022）。关于沉积物，之前没有南极的记录。然而，其他地区的研究表明，废水排放会增加周围沉积物中ARGs和ARBs的丰度（Habibi等人，2022）。此外，受影响区域的这些基因水平远高于原始区域。这使我们推测类似的过程也可能发生在南极。此外，我们研究中观察到的沉积物深层中ARGs的较高丰度可能与南极条约实施之前的历史影响有关。因此，可以合理推测，科学基地通过废水排放造成的人为压力解释了这四个采样点中ARGs的更大积累。热点FI和AI靠近野生动物浓度较高的区域，表明动物活动可能影响ARG水平。最近的一项研究发现，南极半岛80%的海鸟和海洋哺乳动物粪便中的细菌分离株含有抗生素抗性（Gutiérrez等人，2024）。南极 skuas的ARG prevalence较高，可能是由于它们迁徙到印度洋——一个已知的ARG储存库——并在返回南极时携带了这些基因（Segawa等人，2024）。已经证明ARGs在野生动物和水中之间的转移（Zhou等人，2024），表明南极野生动物可以同时作为ARGs的储存库和传播媒介。另外，热点BAE、ES、DE和FI受到科学研究基地物流和日益增长的旅游业的强烈海上交通影响（国际南极旅游运营商协会，无日期），可能增加了ARG的丰度。船舶可以在离岸12海里的地方排放废水，但压载水在南极洲以外的地区（例如上海的港口）已被确定为全球抗生素抗性（ARG）传播的重要媒介，并显著影响全球港口附近的ARG水平（Bonanno Ferraro等人，2024年；Lv等人，2020年）。在BAE、ES和FI这些地点，虽然ARG的绝对丰度很高，但也发现了粪便污染的证据。特别是观察到了拟杆菌科（Bacteroidaceae）的存在，尤其是拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Prevotella），这些细菌是温血动物尤其是人类肠道微生物组的常见组成部分（Daly等人，2006年；Shin等人，2024年）。此外，拟杆菌-普雷沃氏菌群被认为是粪便污染的替代指标，因为它们在海洋环境中具有持久性（Bernhard和Field，2000年）。BAE站点，尤其是在BAE2和BAE3采样点，显示了与粪便污染相关的细菌属数量最多，以及相关ASVs的相对丰度最高。在鉴定出的分类单元中，大肠杆菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）作为近期人类粪便污染的指标尤为突出（Holcomb和Stewart，2020年）。此外，尽管数量较少，但也检测到了毛螺菌属（Lachnoclostridium，属于毛螺菌科），该菌属已被提出作为人类粪便输入的可靠标志物（Newton等人，2011年）。BAE、FI和ES这些地点中高水平的ARG与粪便指示菌的共存表明，这些基因主要是通过废水引入的（Karkman等人，2019年），而不是由于环境中的抗生素暴露而在当地选择的（Hernández等人，2019年）。这一模式凸显了改进科学站废水处理系统的迫切需求。例如，罗瑟拉站（Rothera Station）由于持续的粪便污染，于2003年安装了处理设施（Hughes和Thompson，2004年）。粪便污染分析发现了一些可能存在粪便影响的沉积物样本。在这些样本中，所有样本主要由梭菌纲（Clostridiidae）细菌主导，但没有检测到典型的粪便指示菌如产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），这表明这些细菌可能自然存在于海底（Franco等人，2021年）。同样，乳酸菌（Lactobacillus）也存在，它也可以自然存在于沉积物中（Elayaraja等人，2014年）。在RO-20样本中，普雷沃氏菌的相对丰度较低（0.01%），且仅单独出现，不足以确认粪便污染。5. 结论由于多种污染源、环境影响和采样困难，研究海洋环境中的ARG非常复杂。尽管如此，我们的研究首次概述了南极海洋环境中的抗生素抗性情况，报告了水柱和表层沉积物中tetW、sul1和blaTEM的流行率和丰度。我们提供了南大洋17个地点的数据，这些地点分布在广泛的纬度范围内，通过结合基于16S rRNA的粪便细菌鉴定与人类和野生动物活动足迹的映射来推断潜在来源。虽然某些地点显示出明显的人类或野生动物来源的ARG污染证据，但总体水平仍低于使用类似方法的其他海洋学研究报道的水平，为原始系统建立了一个可靠的基准。这一基准，加上受影响地点的发现，强调了在预计人类活动增加的情况下持续监测的重要性，以及实施环境保护措施和基于“同一健康”（One Health）的政策以保护南大洋的原始状态。作者贡献声明：Gabriel Roscales：撰写——原始草稿、软件使用、方法论设计、调查、数据分析、数据管理；Núria Marquez-Puchol：方法论设计、调查、数据分析、数据管理；Conxita Avila：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、概念构思；Elisenda Ballesté：撰写——审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、调查、资金获取、概念构思。