通过δ2H和脂肪酸分析，揭示了越冬帝王蝶因干旱导致的脂质缺乏现象

《Ecosphere》：Drought-driven lipid deficits in overwintering monarch butterflies revealed by δ2H and fatty acid analysis

　　摘要

东部地区的帝王蝶（Danaus plexippus）在墨西哥的中央火山带过冬，主要依靠迁徙过程中积累的脂质来维持这段长达数月的越冬期。本研究探讨了墨西哥中北部地区的干旱条件如何影响在Sierra Chincua（米却肯州）越冬的帝王蝶的脂质动态，研究覆盖了两个连续的季节。2022-2023年（n=150只）在温和干旱的条件下进行了收集，2023-2024年（n=180只）则在影响整个墨西哥迁徙走廊的极端干旱之后进行了收集。比较了两个年份帝王蝶的腹部质量、脂质质量分数、总脂质质量以及脂肪酸组成。非必需的棕榈酸和油酸的δ2H值被用作饮食能量的来源指标。在两个年份中，非必需脂肪酸都起到了代谢燃料的作用，但在干旱年份所有脂质指标都有显著下降。那些具有较高2H耗尽同位素值的帝王蝶（棕榈酸=0.35；油酸=0.28；p<0.05）显示出较低的脂质质量分数，这表明在极端干旱期间，它们在高海拔越冬地采集花蜜的行为发生了改变，导致脂质积累受限。随着越冬期的结束，脂肪酸的δ2H值逐渐变为负值，而脂质质量分数在两年间趋于一致，这可能是由于现场脂质合成或选择性死亡所致。这些发现表明，与干旱相关的花蜜稀缺可能限制了帝王蝶的脂质积累，因此未来有必要量化墨西哥中北部地区的花蜜质量和花卉丰富度。

引言

东部地区的帝王蝶（Danaus plexippus）在北美东部繁殖，并每年秋季迁徙到墨西哥的火山带越冬（Goehring & Oberhauser, 2002; Urquhart & Urquhart, 1978; Wassenaar & Hobson, 1998）。越冬后，存活的帝王蝶开始春季迁徙，前往美国南部的地区（主要是德克萨斯州）进行繁殖（Brower, 1985; Brower et al., 2006; Urquhart & Urquhart, 1978）。这个越冬期对它们的生存、迁徙以及滞育的结束至关重要（Brower, 1985; Green et al., 2024; Green & Kronforst, 2019; Guerra & Reppert, 2013）；然而，这也伴随着较高的死亡率（Saunders et al., 2019; Shirey & Ries, 2023）。多种因素影响帝王蝶的越冬招募和成功率（Malcolm, 2018; Saunders et al., 2019）。在繁殖范围内，夏季种群数量的减少可能会影响越冬种群和未来的种群稳定性（Pleasants, 2017; Pleasants & Oberhauser, 2013; Taylor et al., 2020）。此外，Davis等人（2024）发现迁徙成功率明显下降，这可能与迁徙路线上的花蜜减少（Rudolph et al., 2006; Saunders et al., 2019）、迁徙期间的不利气候条件（Inamine et al., 2016）以及碰撞导致的死亡有关（Mora Alvarez et al., 2019）。Rich等人（2025）发现，在越冬前经历温暖迁徙条件的帝王蝶表现出更强的越冬繁殖能力和更高的死亡率。由于森林砍伐和气候因素导致的Oyamel冷杉（Abies religiosa）森林丧失，会降低越冬地的热稳定性，使帝王蝶面临不利条件，从而显著增加越冬期间的死亡率（Anderson & Brower, 1996; Brower et al., 2009; Ramirez et al., 2015）。帝王蝶越冬存活的一个关键但研究不足的因素是个体的能量平衡，特别是脂质储备，这是许多迁徙和滞育昆虫的主要能量来源（Arrese & Soulages, 2010; Brower et al., 2006; Forte et al., 2002; Stanley-Samuelson et al., 1988）。帝王蝶严重依赖它们在迁徙过程中积累和储存的脂质来度过越冬期（Beall, 1948; Brower, 1985; Brower et al., 2006）。脂质储备不足的个体很可能无法到达越冬地，或者无法存活下来进行春季迁徙（Alonso-Mejia et al., 1997; Chaplin & Wells, 1982; Masters et al., 1988; Williams & Brower, 2015）。值得注意的是，大部分越冬前的脂质积累似乎发生在通过美国南部并进入墨西哥的后期迁徙阶段（Brower et al., 2006）。最近的研究表明，墨西哥中北部的花蜜资源可能在后期脂质积累中起关键作用。Hobson等人（2023）发现，尽管通过美国南部干旱地区的帝王蝶脂质含量减少，但它们到达墨西哥时的脂质水平与非干旱年份相当，这可能是由于墨西哥的花蜜供应充足所致。2023-2024年的迁徙期间，墨西哥中北部经历了严重至极端的干旱条件（附录S1：图S1）（Monitor de Sequia de México, 2023; National Drought Mitigation Center, 2023）。这与自1993年开始监测以来记录到的最低越冬帝王蝶数量之一同时发生（Rendón-Salinas et al., 2024）。我们假设墨西哥中北部的干旱可能导致越冬种群数量减少，因为关键的花蜜采集地可能因花蜜的质量和数量而受限（Descamps et al., 2021; Kim et al., 2011; Kuppler & Kotowska, 2021）。这种限制理论上会影响帝王蝶的脂质积累。稳定的氢同位素（δ2H）可以追踪饮食能量的地理来源，从而直接检验干旱限制是否改变了帝王蝶的脂质积累。动物组织中的δ2H值可以反映降水中的δ2H值，因为降水同位素值很容易通过食物网传递到消费者组织中。虽然某些组织（如帝王蝶的翅膀几丁质）具有固定的同位素值，反映了出生地（Wassenaar & Hobson, 1998），但由于代谢周转，其他组织的同位素组成是动态变化的。像脂质这样的动态组织可以用来解释短期的空间和时间上的摄食和行为模式（Hobson, 1999; Hobson et al., 2010）。降水中的δ2H值遵循纬度和海拔模式（Hobson et al., 1999），即随着纬度降低，降水δ2H值趋于上升，而海拔升高则导致更负的值（Bowen & West, 2019）。因此，大的海拔变化可能会抵消预期的纬度模式（Terzer et al., 2013）。因此，预计在墨西哥迁徙走廊高海拔地区积累的帝王蝶脂质中的2H含量会比在更北部地区通过花蜜摄取的脂质更少。对帝王蝶的脂质δ2H分析显示，与通过美国南部的迁徙者相比，越冬地的脂质具有负的同位素偏移（Hobson et al., 2020, 2025），这被解释为墨西哥高海拔地区后期花蜜摄取的证据（Hobson et al., 2020）。因此，如果2023-2024年的干旱限制了墨西哥帝王蝶的脂质积累，我们预测δ2H脂质值较低的帝王蝶会有较少的脂质积累。本研究的目的是通过比较两个越冬期的多个脂质指标，来探讨干旱和花蜜限制对墨西哥中北部帝王蝶脂质动态的潜在影响。第一个收集年份（第1年，2022-2023年越冬季节）发生在墨西哥中北部部分地区温和干旱的条件下，而第二个收集年份（第2年，2023-2024年越冬季节）则发生在影响整个墨西哥迁徙走廊的极端干旱年份（Monitor de Sequia en México, 2023; National Drought Mitigation Center, 2023）。我们比较了两个越冬期间帝王蝶的腹部质量、脂质质量分数、总脂质质量以及脂肪酸组成。在构成腹部脂质的脂肪酸中，非必需的棕榈酸和油酸是帝王蝶越冬的主要燃料（Anparasan et al., 2024）。因此，我们的化合物特异性稳定同位素分析重点关注这两个收集年份之间这些脂肪酸的氢同位素组成的变化，作为地理能量来源的指标。我们假设第2年墨西哥中北部的极端干旱会导致越冬脂质储备减少，以及帝王蝶棕榈酸和油酸的同位素组成（δ2H）发生变化。

方法

越冬样本收集

帝王蝶在清晨（8:00–9:30）在墨西哥米却肯州Sierra Chincua越冬地（帝王蝶生物圈保护区）的栖息地被收集。2022-2023年（第1年，n=50，雄/雌）越冬期（2022年12月12日）和2023-2024年（第2年，n=60，雄/雌）越冬期（2023年12月1日），帝王蝶被捕获、鉴定性别并单独放入玻璃封袋中。收集到的帝王蝶立即被运输到UNAM-Campus Morelia并冷冻干燥。这个收集过程在两个越冬期中间（2023年1月16日：n=50；2024年2月6日：n=60）以及越冬期结束前（2023年2月28日：n=50；2024年3月4日：n=60）重复进行。冷冻干燥后的帝王蝶被送往奥地利的实验室，在-80°C下与硅胶干燥包一起储存，以便进行脂质、脂肪酸和同位素分析。每个季节的时间点都对帝王蝶样本进行了破坏性处理。因此，我们的数据反映了不同个体的群体趋势，而不是同一只蝴蝶的重复测量结果。

翅膀δ2H分析

翅膀δ2H值被用作跨越冬期收集的帝王蝶出生地的代理指标（Wassenaar & Hobson, 1998）。帝王蝶的右前翅被放入玻璃小瓶中，加入2:1（v:v）的氯仿：甲醇（VWR Chemicals, Randor, Pennsylvania）溶液，直到翅膀完全浸没。小瓶盖紧闭至少24小时以去除翅膀表面的脂质。然后倾倒溶液并丢弃溶剂。无脂质的翅膀在通风橱中空气干燥超过24小时。干燥后，称量少量翅膀（0.37–0.42毫克）并放入银压胶囊（3.5毫米×5毫米，IVA Analysentechnik, Meerbusch, Germany）中。这些样本在室温下装入Uni-Prep（Eurovector, Milan, Italy）旋转器中，抽真空1小时，然后用氦气冲洗1小时。样本直接引入Elemental Analyser（ThermoFisher Scientific Flash HT）并在1350°C的铬芯片上热解为H2气体。GC解析的H2气体脉冲通过Conflo接口引入DeltaV Advantage稳定同位素质谱仪（ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts）。用于数据标准化的运行内δ2H标准为CBS（-157.0‰）和KHS（-35.3‰）。运行内重复实验的测量误差小于±2‰。所有值均以标准delta（δ）表示，相对于维也纳标准平均海水（VSMOW）标准，单位为千分之一（‰）。

腹部脂肪酸提取和衍生化

脂质从腹部提取，因为腹部是帝王蝶的主要脂质储存部位（Anparasan et al., 2024; Pilecky et al., 2022）。提取使用改良的Folch方法（详见Pilecky et al., 2023），总脂质含量通过重量法确定为腹部干重的质量分数（以微克脂质每毫克干重计）。例如，如果脂质质量分数为500微克/毫克，那么50%的腹部干重是脂质。腹部被称重并放入玻璃小瓶中。将腹部浸泡在冰冷的氯仿（2毫升）中过夜（-80°C）。之后，加入甲醇（1毫升）和0.9% NaCl溶液（750微升），并在3000g离心机（Rotanta 460R, HettichLab, Tuttlingen, Germany）中离心5分钟以分离水溶性溶质。含有溶剂提取的脂质的有机相被收集并在N2气流下蒸发至干燥（N-Evap, Organomation, Berlin, Massachusetts）。然后将总脂质重新悬浮在甲苯（1毫升）中（VWR Chemicals）。通过加入2毫升1% H2SO4并在70°C热水浴中反应2小时，将脂肪酸衍生化为脂肪酸甲酯。甲基化后，加入KHCO3（2毫升）和己烷（500微升），搅拌后静置。上清液被收集并放入气相色谱（GC）小瓶（VWR Chemicals）中，随后在N2气氛下干燥并重新悬浮在己烷（1.5毫升）中。

脂肪酸甲酯的分离使用气相色谱（TRACE GC, ThermoFisher Scientific）与火焰离子化检测器结合进行。进样器温度设定为260°C，载气为氦气，流速为1毫升/分钟。TRACE GC使用Agilent HP-88柱（长度100米，内径25毫米，膜厚度0.2微米）。Chromeleon 7软件（ThermoFisher）用于样本峰积分。使用脂肪酸标准品（37 FAME Mix; Supelco; Sigma-Aldrich, Bellefonte, Pennsylvania）的保留时间来建立已知脂肪酸峰的库。每个样本色谱图中独特的GC峰与37种FAME混合物中已知脂肪酸的保留时间进行了比较，以识别每个样本中的峰。脂肪酸的质量分数以每毫克冻干腹部质量中的微克脂肪酸来量化。脂肪酸的质量分数表示为总脂质质量分数的比例（脂肪酸质量分数/总脂质质量分数）。分析的脂肪酸包括非必需脂肪酸油酸、棕榈酸和硬脂酸，以及必需的多不饱和脂肪酸α-亚麻酸、亚油酸和二十碳五烯酸，因为它们构成了帝王蝶腹部脂质的主要成分（Pilecky等人，2022年）。二十碳五烯酸来源于α-亚麻酸，而α-亚麻酸在花蜜中的含量有限，因此在本研究中被视为必需脂肪酸。2022/2023年收集年的脂质指标（不包括δ2H值）也可以在Anparasan等人（2024年）的研究中找到。化合物特定的稳定同位素分析。

如Pilecky等人（2023年，2024年）所述，样品（按照上述方法制备）被注入配备VF-WAXms柱（Agilent，30米，内径0.32毫米，膜厚度1微米）的TRACE GC（ThermoFisher Scientific）中。分离出的脂肪酸甲酯通过高温转化（HTC）陶瓷反应器在1460°C下热解为H2气体。分离并热解后的样品通过Conflo接口引入Delta V Advantage同位素质谱仪（ThermoFisher Scientific），流速为1.1毫升/分钟，使用He作为载气。运行的参考标准包括USGS70（δ2H = -183.9‰）、USGS71（δ2H = -4.9‰）和USGS72（δ2H = +348.3‰）。脂肪酸的δ2H值以标准δ（δ）表示法报告，相对于VSMOW标准，单位为千分之一（‰）。统计分析

使用三因素方差分析（three-way ANOVAs）和Tukey的事后分析来评估总腹部质量、脂质质量分数、总脂质质量、脂肪酸比例、棕榈酸和油酸的δ2H值以及翅膀的δ2H值，其中年份（第1年和第2年）、越冬采集时间（早期、中期和晚期）和性别作为独立变量。这些分析是使用R Studio（版本4.4.1，2024-06-14 ucrt）进行的。对于脂肪酸比例，在分析之前所有数据都进行了反正弦变换。数据的正态性使用Skew（-2到+2）和Kurtosis（-7到+7）分析进行评估（Curran等人，1996年）。对于所有指标，三因素交互作用不显著；因此，从所有模型中移除了三因素交互作用项。还进行了Pearson相关性分析，比较了给定越冬采集时间内δ2H值与棕榈酸和油酸的质量分数（GraphPad Prism版本10.0）。没有同时具有色谱和同位素值的样品被排除在相关性分析之外（第1年，n = 140；第2年，n = 178）。

在干旱年份（第2年）收集的蝴蝶的腹部脂质质量比前一季节大约低40%–50%（表1）。在早期（Tukey诚实显著差异检验[HSD]：p < 0.0001，所有指标；表2）和中期采集时间（Tukey HSD：p < 0.0001，所有指标）都观察到了年度间的腹部质量、脂质质量分数和脂质质量的差异。然而，在越冬期结束时，这些差异不再明显（Tukey HSD：腹部质量：p = 0.95；脂质质量分数：p = 0.99；脂质质量：p = 0.99）。无论年份如何，所有脂质指标在越冬期间从早期到中期都在下降（Tukey HSD：p < 0.0001，所有指标，表2）。虽然在第1年，腹部质量从中期到后期保持稳定，但脂质质量分数和脂质质量却下降了（Tukey HSD：腹部质量：p = 0.19；脂质质量分数：p < 0.01；脂质质量：p < 0.01）。相比之下，在第2年，腹部质量和脂质质量分数从中期到后期增加了（Tukey HSD：p < 0.01，p < 0.05），而脂质质量保持不变（Tukey HSD：p = 0.10；表1）。

在干旱年份（第2年）收集的蝴蝶的腹部指标和翅膀δ2H值

在干旱年份（第2年）收集的蝴蝶的腹部脂质质量比前一季节大约低40%–50%（表1）。在早期（Tukey诚实显著差异检验[HSD]：p < 0.0001，所有指标；表2）和中期采集时间（Tukey HSD：p < 0.0001，所有指标）都观察到了年度间的腹部质量、脂质质量分数和脂质质量的差异。然而，在越冬期结束时，这些差异不再明显（Tukey HSD：腹部质量：p = 0.95；脂质质量分数：p = 0.99；脂质质量：p = 0.99）。所有脂质指标在越冬期间从早期到中期都在下降，无论年份如何（Tukey HSD：p < 0.0001，所有指标，表2）。虽然在第1年，腹部质量从中期到后期保持稳定，但脂质质量分数和脂质质量却下降了（Tukey HSD：腹部质量：p = 0.19；脂质质量分数：p < 0.01；脂质质量：p < 0.01）。相比之下，在第2年，腹部质量和脂质质量分数从中期到后期增加了（Tukey HSD：p < 0.01，p < 0.05），而脂质质量保持不变（Tukey HSD：p = 0.10；表1）。

表1. 2022–2023年（第1年）和2023–2024年（第2年）越冬期间收集的帝王蝶的腹部质量、脂质质量分数和脂质质量（平均值±标准误差）。

**注：** 干旱年份（第2年）收集的帝王蝶的腹部和脂质指标的年度间差异表明在极端干旱期间脂质消耗严重。字母表示在给定年份内越冬采集时间内的统计显著年度内差异（Tukey诚实显著差异检验[HSD]：p < 0.05）。星号表示在给定越冬采集时间内的年度间统计显著差异（Tukey HSD：p < 0.05）。

表2. 帝王蝶翅膀δ2H、腹部质量、脂质质量分数和脂质质量的三因素方差分析（three-way ANOVAs）的统计结果（所有指标均排除了三因素交互作用项）。

**翅膀δ2H**
**腹部质量**
**腹部脂质质量分数**
**腹部脂质质量**

**Y**
2.48; 1, 320; 0.12
51.96; 1, 320; <0.0001
89.05; 1, 318; <0.0001
99.11; 1, 318; <0.0001

**M**
2.53; 2, 320; 0.08
52.78; 2, 320; <0.0001
36.51; 2, 318; <0.0001
60.32; 2, 318; <0.0001

**S**
0.48; 1, 320; 0.49
16.59; 1, 320; <0.0001
13.69; 1, 318; <0.001
24.32; 1, 318; <0.0001

**Y × M**
0.40; 2, 320; 0.67
8.69; 2, 320; <0.0001
19.84; 2, 318; <0.0001
21.06; 2, 318; <0.0001

**Y × S**
0.08; 1, 320; 0.78
0.38; 1, 320; 0.54
30.08; 1, 318; <0.0001
14.39; 1, 318; <0.0001

**M × S**
0.45; 2, 320; 0.64
0.46; 2, 320; 0.63
2.13; 2, 318; 0.12
2.20; 2, 318; 0.11

**注：** 独立变量包括年份（Y）、越冬期间的采集时间（M）和性别（S）。数值以F值、df值和p值表示。与雄性相比，雌性在越冬期间的腹部质量（约高15.47毫克）、脂质质量分数（约高36.02微克/毫克）和脂质质量（约高10.99毫克）通常更高（Tukey HSD：p < 0.001，所有指标；表2）。然而，对于脂质质量分数和总脂质质量，这些基于性别的差异在第1年显著（Tukey HSD：p < 0.001，两个指标），但在第2年不显著（Tukey HSD：脂质质量分数：p = 0.78；脂质质量：p = 0.69）。额外的性别相关比较见附录S1。帝王蝶翅膀δ2H值在越冬期间、年份和性别之间相似（图1）。

图1. 2022–2023年（第1年）和2023–2024年（第2年）越冬期间收集的帝王蝶的翅膀δ2H值（‰）。箱子代表四分位数范围（Q1–Q3），中位数作为中线。须状线代表四分位数范围内的数据，数据点代表超出此范围的数据。字母表示在给定年份内越冬采集时间内的统计显著年度内差异（Tukey诚实显著差异检验[HSD]：p < 0.05）。对于给定的越冬采集时间（早期、中期或晚期），未观察到年度间的显著差异（Tukey HSD：p < 0.05）。

**非必需脂肪酸的比例**

在两年中，非必需脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸和油酸）构成了越冬帝王蝶腹部的主要脂肪酸（图2）。硬脂酸和油酸的比例在年份间保持一致（表3）。然而，棕榈酸的比例在第2年显著更高（Tukey HSD：p < 0.0001），主要是由于最后一次采集时的显著差异（在最后一次采集时高出约0.09；Tukey HSD：p < 0.0001）。年度内的变化见附录S1。

表3. 2022–2023年（第1年）和2023–2024年（第2年）越冬期间收集的帝王蝶腹部中棕榈酸（PA）、硬脂酸（ST）、油酸（OL）、亚油酸（LA）、α-亚麻酸（ALA）和二十碳五烯酸（EPA）的比例的统计结果（三因素方差分析，所有指标均排除了三因素交互作用项）。

**注：** 独立变量包括年份（Y）、越冬期间的采集时间（M）和性别（S）。数值以F值、df值和p值表示。与雄性相比，雌性在越冬期间的腹部质量（约高15.47毫克）、脂质质量分数（约高36.02微克/毫克）和脂质质量（约高10.99毫克）通常更高（Tukey HSD：p < 0.001，所有指标；表2）。然而，对于脂质质量分数和总脂质质量，这些基于性别的差异在第1年显著（Tukey HSD：p < 0.001，两个指标），但在第2年不显著（Tukey HSD：脂质质量分数：p = 0.78；脂质质量：p = 0.69）。额外的性别相关比较见附录S1。帝王蝶翅膀δ2H值在越冬期间、年份和性别之间相似（图1）。

图1. 2022–2023年（第1年）和2023–2024年（第2年）越冬期间收集的帝王蝶的翅膀δ2H值（‰）。箱子代表四分位数范围（Q1–Q3），中位数作为中线。须状线代表四分位数范围内的数据，数据点代表超出此范围的数据。字母表示在给定年份内越冬采集时间内的统计显著年度内差异（Tukey诚实显著差异检验[HSD]：p < 0.05）。对于给定的越冬采集时间（早期、中期或晚期），未观察到年度间的显著差异（Tukey HSD：p < 0.05）。

**腹部必需脂肪酸的比例**

在两年中，非必需脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸和油酸）构成了越冬帝王蝶腹部的主要脂肪酸（图2）。硬脂酸和油酸的比例在年份间保持一致（表3）。然而，棕榈酸的比例在第2年显著更高（Tukey HSD：p < 0.0001），主要是由于最后一次采集时的显著差异（在最后一次采集时高出约0.09；Tukey HSD：p < 0.0001）。年度内的变化见附录S1。

表3. 2022–2023年（第1年）和2023–2024年（第2年）越冬期间收集的帝王蝶腹部中棕榈酸（PA）、硬脂酸（ST）、油酸（OL）、亚油酸（LA）、α-亚麻酸（ALA）和二十碳五烯酸（EPA）的比例的统计结果（三因素方差分析，所有指标均排除了三因素交互作用项），以及棕榈酸和油酸的δ2H值。

**注：** 独立变量包括年份（Y）、越冬期间的采集时间（M）和性别（S）。数值以F值、df值和p值表示。

**注：** 在越冬的帝王蝶腹部中可以测量到亚油酸、α-亚麻酸和二十碳五烯酸。第2年的亚油酸和α-亚麻酸的比例比第1年高（分别高约1.3e?3和6.6e?3；表3；Tukey HSD：p < 0.0001），尽管这种差异在越冬期结束时没有持续（Tukey HSD：亚油酸：p = 0.93；α-亚麻酸：p = 0.99）。二十碳五烯酸的比例在第2年也普遍更高（约高1.5e?4；Tukey HSD：p < 0.0001）；然而，这种差异仅在中期和晚期采集时显著（Tukey HSD：p < 0.0001）。年度内的变化见附录S1。

**注：** 棕榈酸和油酸的δ2H值存在显著的年度间差异（图3）。棕榈酸的δ2H在第1年始终更高（约高55.7‰；表3；Tukey HSD：p < 0.0001）。相比之下，油酸的δ2H值显示出混合模式：在早期采集时更高，在中期更低，在晚期则没有显著差异（Tukey HSD：p < 0.0001，p < 0.0001，p = 1.00）。在第二年，棕榈酸的同位素耗竭在采集时间结束时不太明显（约8.0‰的耗竭；Tukey HSD：p = 0.21），而油酸的δ2H值降低到中间水平（约7.5‰的耗竭），与早期（Tukey HSD：p = 0.05）和中期采集（Tukey HSD：p = 0.75）相比有所变化。在第一年到达越冬地时，这两种脂肪酸的δ2H值与其质量分数没有相关性（皮尔逊相关系数，棕榈酸 = 0.20，p = 0.17；油酸 = 0.12，p = 0.42；图4A,B）。在第二年，到达时这两种脂肪酸的δ2H值与其质量分数呈正相关（皮尔逊相关系数，棕榈酸 = 0.35；油酸 = 0.28；两种脂肪酸均p < 0.05；图4C,D）。在采集中期，无论在哪一年，这两种脂肪酸的δ2H值与其相应的质量分数都没有相关性（皮尔逊相关系数，第一年：棕榈酸 = -0.21，p = 0.17；油酸 = 0.16，p = 0.30；第二年：棕榈酸 = -0.17，p = 0.19；油酸 = -0.12，p = 0.37）。在第一年越冬期结束时，帝王蝶腹部的δ2H值与其相应的脂肪酸质量分数相关，即脂肪酸含量较低的帝王蝶具有更负的同位素组成（皮尔逊相关系数，棕榈酸 = 0.41；油酸 = 0.57；两种脂肪酸均p < 0.01）。在第二年结束时，脂肪酸的δ2H值与采集期间的质量分数没有相关性（皮尔逊相关系数，棕榈酸 = -0.13，p = 0.34；油酸 = 0.16，p = 0.23）。图4在图形查看器中打开。

图4显示了2022-2023年（第一年）和2023-2024年（第二年）越冬期间收集的帝王蝶腹部中油酸（OL）和棕榈酸（PA）的δ2H值（‰）与每种脂肪酸的质量分数的关系。

**讨论**

在极端干旱年份越冬的帝王蝶表现出显著较低的脂质含量，这一现象与它们的出生地和迁徙距离无关（通过每年相似的翅膀δ2H值推断得出）。非必需脂肪酸的组成在各年之间没有显著差异；然而，非必需脂肪酸的稳定氢同位素组成在不同年份和整个越冬期间有显著变化，这可能反映了干旱对脂肪酸积累的影响。这些结果支持了墨西哥中北部迁徙路线上的蜜源地以及越冬地点对越冬帝王蝶脂质积累的重要性（Hobson等人，2023年）。在第一年，Sierra Chincua的脂质质量分数和质量高于极端干旱年份（第二年），无论是在早期还是中期采集点。最近对到达越冬地的帝王蝶的脂质质量测量（2019-2021年）与第一年的数值相当（Hobson等人，2023年），而第二年的帝王蝶脂质质量明显较低。此外，第二年的帝王蝶脂质质量明显低于早期研究中在Sierra Chincua采集的帝王蝶（平均脂质质量为100-140毫克；Masters等人，1988年；Alonso-Mejia等人，1997年；Brower等人，2015年）。这支持了第二年脂质含量较低的假设可能与干旱有关。墨西哥的干旱条件可能干扰了第二年的脂质积累，因为产蜜植物可能遭受死亡、开花量减少（Descamps等人，2021年；Kim等人，2011年；Kuppler & Kotowska，2021年）或蜜汁粘度增加，这会由于口器限制而影响帝王蝶的取食效率（Krenn，2010年；Nicolson，2007年；Romeis等人，2005年）。这可能会限制以干旱胁迫植物为食的帝王蝶的脂质合成和保留，正如Brower等人（2015年）所观察到的。尽管第二年的脂质质量分数和质量较低，但这些帝王蝶仍有足够的脂质完成迁徙并开始越冬。因此，另一种解释可能是，第二年越冬种群的显著减少（Rendón-Salinas等人，2024年）突显了那些具有足够脂质以到达并存活越冬的帝王蝶的选择。尽管脂质质量分数有所波动，棕榈酸和油酸的比例在整个越冬期间相对保持稳定，表明非必需脂肪酸是脂质含量变化的主要贡献者。这与其他鳞翅目昆虫的观察结果一致（Murata & Tojo，2002年；Sakamoto等人，2004年；Wang & Ouyang，1995年）。相比之下，必需脂肪酸既不容易获得也不容易丢失，因为脂质含量的变化不大。因此，失去非必需脂肪酸的帝王蝶相应地具有更高比例的必需脂肪酸（即必需脂肪酸更容易被保留）。值得注意的是，干旱年份棕榈酸的比例较高。作为油酸的生化前体（Karasov & del Martinez Rio，2007年；Lambremont等人，1965年），棕榈酸可以在寒冷条件下转化为提高脂质储存的流动性（Bale & Hayward，2010年；Sinclair & Marshall，2018年）。然而，这种转化在能量上代价较高。我们认为，干旱期间有限的脂质可用性减少了棕榈酸向油酸的转化，导致第二年棕榈酸比例升高。最近的研究强调了墨西哥和美国南部等地区晚期迁徙期间觅食的重要性，因为这些地区是越冬生存的主要脂质积累区域（Brower等人，2006年；Hobson等人，2023年）。然而，这些地区的同位素组成有所不同，美国南部的地区由于纬度降低而同位素富集，而靠近墨西哥中北部越冬地点的地区由于海拔升高而同位素耗竭（Bowen & West，2019年；Hobson等人，1999年；Terzer等人，2013年）。在第一年，非必需脂肪酸的δ2H值与到达越冬地点时的脂肪酸含量之间没有显著关系，表明沿墨西哥迁徙路线觅食后脂质积累有效。相比之下，在极端干旱年份（第二年），非必需脂肪酸含量较低的个体表现出更负的δ2H值，表明在高海拔地区的干旱胁迫蜜源处脂质积累效率低下（Hobson等人，1999年，2020年）。然而，其他因素如翅膀形态、身体状况或迁徙时间也可能影响脂质积累和越冬招募（Flockhart等人，2017年；Gibo & McCurdy，1993年；Schroeder等人，2020年）。未来的研究应考虑这些因素以更好地理解帝王蝶脂质动态的变化。在整个越冬期间，非必需脂肪酸的δ2H值的变化表明了代谢过程。从早期到中期，同位素2H的富集表明了脂质的分解，优先氧化较轻的同位素以获取能量（DeNiro & Epstein，1977年；Hobson等人，2010年；Peterson & Fry，1987年；Sessions等人，1999年）。有趣的是，两年都观察到了季节末期2H耗竭的趋势。在第二年，这种耗竭与脂质质量分数的增加同时发生，这可能表明在越冬后期从蜜汁中合成了新的脂质。鉴于高海拔地区的降水和地下水δ2H值更负（Sanchez-Murillo等人，2023年；Wassenaar等人，2009年），越冬地点的后期脂质合成应该会产生2H耗竭的非必需脂肪酸。然而，越冬地点的蜜汁供应相对于帝王蝶的数量来说是有限的（Brower等人，1977年），因此虽然可能有一些后期越冬取食，但我们不能假设这是一种一致的现象。此外，生存偏差也可能影响脂质含量和H同位素组成模式。虽然我们的研究关注了整个越冬期间的脂质动态变化，但这种时间模式无法在同一只帝王蝶身上进行研究。两个越冬期结束时脂质指标的趋同可能反映了选择性死亡，只有具有足够脂质储备的帝王蝶才能存活（Alonso-Mejia等人，1997年；Masters等人，1988年）。因此，极端干旱年份末期脂质含量的增加可能反映了具有不足储备的帝王蝶的选择性死亡，而不是通过后期蜜汁取食在原地合成脂质。值得注意的是，棕榈酸和油酸的比例在整个越冬期间相对稳定，表明非必需脂肪酸是脂质含量变化的主要贡献者。这与其他鳞翅目昆虫的观察结果一致（Murata & Tojo，2002年；Sakamoto等人，2004年；Wang & Ouyang，1995年）。相比之下，必需脂肪酸既不容易获得也不容易丢失，因为脂质含量的变化不大。因此，失去非必需脂肪酸的帝王蝶相应地具有更高比例的必需脂肪酸（即必需脂肪酸更容易被保留）。值得注意的是，干旱年份棕榈酸的比例较高。作为油酸的生化前体（Karasov & del Martinez Rio，2007年；Lambremont等人，1965年），棕榈酸可以在寒冷条件下转化为提高脂质储存的流动性（Bale & Hayward，2010年；Sinclair & Marshall，2018年）。然而，这种转化在能量上代价较高。我们提出，干旱期间有限的脂质可用性减少了棕榈酸向油酸的转化，导致第二年棕榈酸比例升高。最近的研究强调了墨西哥和美国南部等地区晚期迁徙期间觅食的重要性，因为这些地区是越冬生存的主要脂质积累区域（Brower等人，2006年；Hobson等人，2023年）。然而，这些地区的同位素组成不同，美国南部的地区由于纬度降低而同位素富集，而靠近墨西哥中北部越冬地点的地区由于海拔升高而同位素耗竭（Bowen & West，2019年；Hobson等人，1999年；Terzer等人，2013年）。在第一年，没有发现非必需脂肪酸的δ2H值与到达越冬地点时的脂肪酸含量之间存在显著关系，表明沿墨西哥迁徙路线觅食后脂质积累有效。相比之下，在极端干旱年份（第二年），非必需脂肪酸含量较低的个体表现出更负的δ2H值，表明在高海拔地区的干旱胁迫蜜源处脂质积累效率低下（Hobson等人，1999年，2020年）。然而，其他因素如翅膀形态、身体状况或迁徙时间也可能影响脂质积累和越冬招募（Flockhart等人，2017年；Gibo & McCurdy，1993年；Schroeder等人，2020年）。未来的研究应考虑这些因素以更好地理解帝王蝶脂质动态的变化。在整个越冬期间，非必需脂肪酸的δ2H值的变化表明了代谢过程。从早期到中期，同位素2H的富集表明了脂质的分解，优先氧化较轻的同位素以获取能量（DeNiro & Epstein，1977年；Hobson等人，2010年；Peterson & Fry，1987年；Sessions等人，1999年）。有趣的是，两年都观察到了季节末期2H耗竭的趋势。在第二年，这种耗竭与脂质质量分数的增加同时发生，这可能表明在越冬后期从蜜汁中合成了新的脂质。鉴于高海拔地区的降水和地下水δ2H值更负（Sanchez-Murillo等人，2023年；Wassenaar等人，2009年），越冬地点的后期脂质合成应该会产生2H耗竭的非必需脂肪酸。然而，越冬地点的蜜汁供应相对于帝王蝶的数量来说是有限的（Brower等人，1977年），因此虽然可能有一些后期越冬取食，但我们不能假设这是一种一致的现象。此外，生存偏差也可能影响脂质含量和H同位素组成模式。虽然我们的研究关注了整个越冬期间的脂质动态变化，但这种时间模式无法在同一只帝王蝶身上进行研究。两个越冬期结束时脂质指标的趋同可能反映了选择性死亡，只有具有足够脂质储备的帝王蝶才能存活（Alonso-Mejia等人，1997年；Masters等人，1988年）。因此，极端干旱年份末期脂质含量的增加可能反映了具有不足储备的帝王蝶的选择性死亡，而不是通过后期蜜汁取食在原地合成脂质。此外，需要个体水平的追踪来区分这些机制。第一年结束时脂肪质量分数非常低且δ2H值负的帝王蝶也可能反映了有限残留幼虫来源脂质的动员（Wang & Haunerland，1992年），这些脂质由于北部出生地的原因而具有更负的同位素。尽管通常认为帝王蝶在越冬期间不取食蜜汁，但有些研究观察到在滞育终止期间（即越冬期末）或脂质含量较低的帝王蝶会取食蜜汁（Alonso-Mejia等人，1997年；Calvert & Lawton，1993年）。滞育终止可能会影响取食行为（Dingle & Winchell，1997年；Perry，2011年；Green & Kronforst，2019年；Van Hook，1993年），因为交配和激素变化（Green & Kronforst，2019年；Van Hook，1993年）。此外，年际气候变化可能会影响越冬地点提供蜜汁的植物的分布和开花时间（Cornejo-Tenorio & Ibarra-Manríquez，2007年）。因此，帝王蝶的蜜汁消耗（特别是在越冬期末）可能在帝王蝶的生存中起重要作用（尽管这方面的研究较少，但参见Sánchez-Tlacuahuac等人，2023年）。我们承认并非所有帝王蝶都在取食蜜汁；然而，这种行为可能会影响一些帝王蝶的生存。因此，我们建议未来的研究重新评估迁徙前蜜汁取食的空间重要性。最后，这里和先前研究（Hobson等人，2025年）观察到的脂肪酸δ2H值的显著年际变化强调了需要对北美帝王蝶脂肪酸进行基线同位素研究，以帮助确定脂质的地理来源。尽管这不是当前研究的目标，但建立这样的参考将有助于更好地了解脂质的地理来源，并更好地解决干旱和迁徙如何影响越冬能量储备。此外，帝王蝶脂肪酸的基线同位素映射可能允许对后期越冬取食的潜在作用进行精确推断。如果在越冬期末观察到的同位素耗竭表明脂肪酸来源更接近越冬地点，这可能为后期蜜汁取食在帝王蝶越冬能量动态中的作用提供新的见解。正如本研究中观察到的脂质趋势所示，干旱可能会通过限制越冬前的蜜汁可用性对脂质积累产生显著压力。随着迁徙期末栖息地规模的减少（Davis等人，2024年）和帝王蝶越冬种群规模的总体下降（Rendón-Salinas等人，2024年），保护墨西哥中北部的蜜源走廊对于维持成功的帝王蝶迁徙可能极为重要。此外，随着干旱发生频率和严重程度的增加，其他以蜜汁为食的迁徙昆虫也可能受到脂质积累的负面影响。

**作者贡献**

Libesha Anparasan、Leonard I. Wassenaar和Keith A. Hobson设计了这项研究。Libesha Anparasan和Matthias Pilecky进行了脂质和数据分析。M. Isabel Ramirez收集了样本。Libesha Anparasan、Leonard I. Wassenaar和Matthias Pilecky负责手稿的撰写。Martin J. Kainz和M. Isabel Ramirez协助了手稿编辑。所有作者都对手稿进行了严格评估。

**致谢**

我们哀悼我们的同事和合著者Keith Hobson博士在2024年10月的离世。我们感谢CIGA-UNAM莫雷利亚校区的研究人员迅速而高效地准备和运送了帝王蝶样本。

**利益冲突声明**

作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**

数据（Anparasan等人，2026年）可从Dryad获取：https://doi.org/10.5061/dryad.cfxpnvxkn。