桉树的木质素生产与Cellic? CTec3 HS酶促水解相结合，将木质素转化为单糖

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Eucalyptus lignin production coupled with Cellic ? CTec3 HS enzymatic hydrolysis to monosaccharides

　　摘要
本研究的目的是设计、开发并优化一种两步工艺，用于从桉树（Eucalyptus globulus）残渣中提取木质素，随后将剩余的全纤维素转化为单糖，主要是葡萄糖和木糖。首先，采用了一种新的水-有机-热处理方法来优化高质量木质素的溶解度，该方法使用稀释的咪唑水溶液代替纯咪唑。随后，通过使用商业酶混合物Cellic? CTec3 HS（诺维信公司，丹麦Bagsv?rd）并添加来自Trichoderma viride（默克公司，德国Darmstadt）的内切-1,4-β-木聚糖酶，优化了富含多糖的预处理固体的酶促水解过程，以生成葡萄糖和木糖。通过对多个参数（如咪唑浓度、温度、反应时间和固液比）的调整，对提取过程进行了全面优化。在最佳反应条件下（咪唑浓度35 wt%，生物质负载量10 wt%，温度120°C，反应时间2小时，转速400 rpm），整个过程中木质素的去除率达到了约70 wt%，同时葡萄糖和木糖的产率分别为99 mol%和92 mol%，水解液中的总糖浓度达到了91 g/L。

关键点
• 提出了一种新的木质纤维素生物质的水-有机-热处理方法。
• 在低酶剂量下，48小时内葡萄糖和木糖的产率分别为99 mol%和92 mol%。
• 水解液中的总还原糖浓度达到了91 g/L。

引言
2020年，欧盟制定了并批准了“欧盟绿色协议”，旨在到2050年实现碳中和，并大力推动环保且更加公平的循环生物经济。在此背景下，需要开发创新且低影响的解决方案和技术，以用可再生资源替代化石燃料，用于生产可持续燃料、化学品和材料（Asghar等人，2022年；Caporusso等人，2025b年）。
戊糖和己糖（如木糖和葡萄糖）是生物精炼过程中最重要和最常见的平台分子（Pandey和Sharma，2024年）。这些糖是通过生物质多糖的水解反应产生的，该反应可以通过酸性（有机或无机）或酶促途径实现（Di Fidio等人，2024年）。通过预处理、分馏和水解等不同过程，生物质衍生的单糖混合物可以通过生物或化学方法转化为多种高价值化学品（Di Fidio等人，2024年；Fulignati等人，2024年；Pandey和Sharma，2024年）。生物精炼厂所选择的技术、转化过程和最终产品受到原材料化学成分、全球市场需求以及特定工艺技术成熟度的强烈影响。在使用木质纤维素生物质作为原料的生物精炼厂中，会进行预处理以降低生物质的抗性（Caporusso等人，2025a年）。这会产生富含多糖和木质素的组分。由于木质纤维素生物质转化所需的严格条件，木质素容易发生缩合反应，形成难以进一步转化的化学结构（D’Orsi等人，2023年）。因此，这种木质素通常被视为废物，并在废物转化为能源的过程中被燃烧以产生能量、热量和/或蒸汽。然而，近年来出现了一种新的策略，即“先利用木质素”的策略，在这种策略中，木质素的增值与碳水化合物的增值同时进行（Luo等人，2023年；Paone等人，2020年）。
在本研究中，设计、开发并优化了一种创新的“先利用木质素”的生物精炼方案，用于利用桉树混合残渣。桉树是一种生长迅速的树木，目前是全球纸浆和造纸业的主要硬木来源之一，这一过程会产生大量的残渣，如树枝、树皮和叶子。所有这些残渣都可以被重新利用来生产第二代单糖（López等人，2020年）。所选的木质纤维素生物质首先采用了一种基于水溶液中的咪唑的水-有机-热处理方法进行预处理，得到了富含多糖的固体残渣和富含可溶性木质素的液体组分。然后通过酸性环境中的沉淀回收木质素，随后进行过滤，并对其进行了表征，为未来的增值研究做准备。固体残渣使用创新的商业混合物Cellic? CTec3 HS（诺维信公司，丹麦Bagsv?rd）和来自Trichoderma viride（默克公司，德国Darmstadt）的内切-1,4-β-木聚糖酶进行酶促水解，以提高半纤维素组分的水解效率（D’Orsi等人，2023年）。
咪唑具有多种优点，包括低毒性、低表面张力、高热稳定性、高水溶性以及显著的亲核性和反应性，使其适用于溶剂热处理过程（Savian等人，2024年）。此外，它比离子液体和深共晶溶剂更具成本效益，且不需要特殊的防腐设备（Valladares-Diestra等人，2023年）。
迄今为止，科学文献中只有少数研究探讨了使用纯咪唑进行生物质预处理的方法。Morais等人（2016年）和Savian等人（2024年）首次在110至170°C的温度范围内，用纯咪唑对小麦秸秆进行了1至4小时的预处理。他们证明，在最佳反应条件下（170°C，2小时，生物质负载量9 wt%），木质素的去除率为80 wt%（相对于未经处理的生物质中的木质素含量），得到了富含多糖的固体残渣。当这种残渣使用两种商业酶Celluclast? 1.5L和β-葡萄糖苷酶Novozym 188的混合物进行酶促水解时，葡萄糖的产率约为99 mol%。
Valladares-Diestra等人（2023年）使用纯咪唑对四种不同的生物质类型进行了预处理，分别是油棕空果串、甘蔗渣、大豆壳和可可豆荚壳，这些生物质含有不同的木质素含量。在每种生物质的最佳反应条件下（油棕空果串180°C，1小时；甘蔗渣160°C，1小时；大豆壳120°C，1小时；可可豆荚壳180°C，2小时），木质素的去除率约为70 wt%。随后，通过使用Cellic? CTec2酶混合物进行酶促水解，富含多糖的固体残渣产生了80–90 mol%的葡萄糖。
此外，根据文献报道，红外光谱分析显示，咪唑处理后的固体残渣中含有比原始生物质更多的II型纤维素。这种结晶态纤维素更容易被酶促水解，并且可以通过碱性生物质处理获得（Morais等人，2016年；Nagarajan等人，2017年；Valladares-Diestra等人，2023年）。
尽管纯咪唑效率较高，但它也有一些缺点。这些缺点包括高熔点（90°C）、密度高于水（标准条件下为1.23 g/cm3），尤其是成本高于有机溶剂技术中使用的传统有机溶剂。其高沸点（256°C）使得在工业规模上难以回收纯溶剂，因为这会增加蒸馏和下游处理的能量和成本。此外，Morais等人（2016年）和Pereira等人（2021a，b）报告称，使用纯咪唑的剧烈反应条件（140–170°C，2–4小时）会对木质素结构造成显著影响，导致木质素发生解聚。
在本研究中，首次测试了稀释的咪唑，以减少咪唑的消耗并促进溶解后的木质素沉淀。具体来说，研究了不同浓度的稀释咪唑水溶液（25 wt%，35 wt%）与不同反应时间（1小时、2小时和3小时）和温度（60°C、90°C和120°C）的组合，并进行了优化。这一选择旨在从环境和经济角度改进工艺，符合绿色化学和循环生物经济的原则（Kururl等人，2025年）。

材料与方法
桉树混合残渣由The Navigator Company（葡萄牙Cacia）提供。木质纤维素生物质在马弗炉中于105°C下干燥过夜，研磨至颗粒大小约为0.5 cm，然后储存在干燥器中。
用于高效液相色谱（HPLC）的水、咪唑（≥99%）、四氢呋喃（≥99%）、硫酸（98%）、葡萄糖（99.5%）、木糖（95%）、阿拉伯糖（95%）、甘露糖（≥99%）、半乳糖（≥99%）、冰醋酸（99.7%）、乙酰溴（99%）、聚（苯乙烯磺酸盐）钠盐标准品（分子量范围891–258,000 g/mol）以及来自Trichoderma viride的内切-1,4-β-木聚糖酶（200国际单位（IU）/mg蛋白质）由默克公司（德国Darmstadt）提供。酶混合物Cellic? CTec3 HS由诺维信公司（丹麦Bagsv?rd）提供，其酶活性为195 Filter Paper Unit（FPU）/g溶液。所有试剂均按接收时的状态使用。

生物质流的化学成分测定
通过美国国家可再生能源实验室（NREL）的标准程序（Sluiter等人，2004a,b, 2008a,b）测定了桉树混合残渣及整个生物精炼过程中产生的所有固体流的化学成分。每个样品进行了三次分析，并计算了其标准偏差。

基于咪唑的水-有机-热处理用于木质素溶解
在300 mL Parr?反应器（Autoclave Buchi Limbo-li?，瑞士Zurich）中，使用稀释的咪唑水溶液对桉树残渣进行了水-有机-热处理，加入100 g每种溶液和10 g干燥生物质。咪唑和水的相对量根据实验设置（25 wt%和35 wt%）进行调节。混合物在400 rpm下搅拌。通过测试60°C、90°C和120°C以及1小时、2小时和3小时，研究了温度和反应时间的影响。反应结束后，反应器通过外部气流冷却、减压并打开。所得浆液在真空条件下通过烧结玻璃过滤器过滤。收集的固体用去离子水洗涤至中性，然后在马弗炉中于105°C下干燥过夜，并称重以确定获得的残渣量（Sluiter等人，2008a,b）。通过加入适量的98 wt% H2SO4将过滤液相中的木质素沉淀出来，最终pH值达到2。溶液在4°C下放置过夜，然后通过5000 rpm离心5分钟分离沉淀的木质素。固体用丙酮（固液比1:10 w/v）洗涤以去除剩余的咪唑，再用去离子水洗涤。最后，木质素在45°C的真空条件下干燥至恒重，然后储存在干燥器中。木质素溶解率的计算公式如下：
$$\mathrm{Lignin}\;\mathrm{solubilisation}\;(\mathrm{wt}\%)\:=\:\lbrack(\mathrm{lignin}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)-\mathrm{lignin}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{pretreated}\;\mathrm{solid}\;(\mathrm g))/\mathrm{lignin}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)\rbrack\;100$$
$$\mathrm{Glucan}\;\mathrm{removal}\;(\mathrm{wt}\%)\:=\:\lbrack(\mathrm{glucan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)-\mathrm{glucan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{pretreated}\;\mathrm{solid}\;(\mathrm g))/\mathrm{glucan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)\rbrack\;100$$
$$\mathrm{Xylan}\;\mathrm{removal}\;(\mathrm{wt}\%)\:=\:\lbrack(\mathrm{xylan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)-\mathrm{xylan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{pretreated}\;\mathrm{solid}\;(\mathrm g))/\mathrm{xylan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{raw}\;\mathrm{biomass}\;(\mathrm g)\rbrack\;100$$

酶促水解
酶促水解反应在500 mL的搅拌式生物反应器（Braun Biotech International，德国Melsungen）中进行，使用100 mL的0.05 M柠檬酸缓冲液、适量的富含多糖的干燥固体残渣、酶混合物Cellic? CTec3 HS和内切-1,4-β-木聚糖酶，按照实验计划进行。搅拌器的速度设置为200 rpm。研究了生物质负载量（10 wt%、15 wt%、20 wt%）和酶剂量（15 FPU、25 FPU、35 FPU的Cellic? CTec3 HS/g葡萄糖，加上10国际单位（IU）的内切-1,4-β-木聚糖酶/g木聚糖）的影响。根据Michaelis-Menten模型，研究了每个反应的动力学，直到达到平台期。反应结束后（48小时后），悬浮液在4°C下冷却以停止反应，并通过烧结玻璃过滤器过滤。液体组分的一部分通过0.22 μm注射器过滤器过滤后，注入高效离子色谱（HPIC）进行糖分定量。固体残渣在马弗炉中于105°C下放置过夜以测定干物质含量（Sluiter等人，2008a,b）。葡萄糖和木糖的产率通过以下公式计算：
$$\mathrm{Glucose}\;\mathrm{yield}\;(\mathrm{mol}\%)\:=\:\lbrack\mathrm{glucose}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{hydrolysate}\;(\mathrm{mol})/\mathrm{glucan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{pretreated}\;\mathrm{solid}\;(\mathrm mol})\rbrack\;100$$
$$\mathrm{Xylose}\;\mathrm{yield}\;(\mathrm{mol}\%)\:=\:\lbrack\mathrm{xylose}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{hydrolysate}\;(\mathrm{mol})/\mathrm{xylan}\;\mathrm{in}\;\mathrm{the}\;\mathrm{pretreated}\;\mathrm{solid}\;(\mathrm mol})\rbrack\;100$$

化学分析
单糖通过HPIC Dionex ICS-2500系统（Thermo Fisher Scientific，美国Waltham，MA）进行定量，该系统配备Nucleogel Ion 300 OA柱（Macherey-Nagel，德国Düren），操作温度为40°C，流动相为2.5 mM H2SO4（流速为0.4 mL/min）。检测器为Shodex RI-101折射率检测器（PerkinElmer Italia Spa，意大利Milano）。醋酸通过HP1100系统进行定量，该系统配备Dionex AS1柱（Thermo Fisher Scientific，美国Waltham，MA），操作温度为30°C，流动相为Milli-Q水/乙腈（流速为0.7 mL/min），检测器为二极管阵列。标准和反应样品分析了三次，平均实验误差≤4%。

元素分析
使用Vario MICRO Cube有机元素分析仪（Elementar，德国Langenselbold）对木质纤维素样品进行了元素分析（C、H、N、S）。氧含量是通过方程式6计算得出的：$$\mathrm O\;(\mathrm{wt}\%)\:=\:100\;(\mathrm{wt}\%)-(\mathrm C\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:\mathrm H\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:\mathrm N\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:\mathrm S\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:\mathrm{ash}\;(\mathrm{wt}\%)$$ （6） 高热值（HHV）是使用Channiwala和Parikh（2002年）提出的方程式7计算的，如下所示：$$\mathrm{HHV}\;(\mathrm{MJ}/\mathrm{kg})\:=\:0.3491\cdot\mathrm C\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:1.1783\cdot\mathrm H\;(\mathrm{wt}\%)\:+\:0.1005\cdot\mathrm S\;(\mathrm{wt}\%)-0.1034\cdot\mathrm O\;(\mathrm{wt}\%)-0.0151\cdot\;\mathrm N\;(\mathrm{wt}\%)-0.0211\cdot\;\mathrm{ash}\;(\mathrm{wt}\%)$$ （7） 红外（IR）光谱分析 使用了配备MIRacle ATR附件的PerkinElmer Spectrum GX光谱仪（PerkinElmer Italia Spa，米兰，意大利）来获取衰减全反射（ATR）傅里叶变换（FT）红外光谱。光谱的采集范围是450–4000 cm?1，分辨率为8 cm?1，共进行了64次扫描。

热重分析（TGA） 使用了4毫克的木质素样品进行TGA，以确定其热稳定性、水分含量和挥发性物质。TGA是在Perkin Elmer TGA 7设备上进行的（PerkinElmer Italia Spa，米兰，意大利）。测试采用了不同的加热速率：从25°C到260°C为5.5°C/min；然后到380°C为6°C/min；到510°C为7.5°C/min；到630°C为7.5°C/min；到900°C为17°C/min。N2气体流量为20 mL/min，并在入口处保持恒定。

凝胶渗透色谱（GPC） 在进行GPC分析之前，首先对木质素进行了乙酰化处理，以提高其在用于色谱仪洗脱的溶剂（四氢呋喃，THF）中的溶解度。对于乙酰溴化反应，将50毫克的木质素悬浮在10毫升的冰醋酸/乙酰溴（9:1 v/v）中2小时。然后在真空下完全去除溶剂，将残留物溶解在THF（10毫升）中，并通过0.45微米的注射器过滤器过滤后进行注射。木质素溶液在Agilent HP 1100系列LC系统上进行分析（Agilent Technologies，圣克拉拉，加州，美国），该系统配备了GPC柱TSKgel-G4000HHR、TSKgel-G3000HHR和TSKgel-G2500HHR，通过连接Agilent 1260 ELSD检测器来确定平均分子量，设置蒸发器温度为42°C，雾化器温度为30°C，并使用1.19 mL/min的氮气流量。标准校准使用了聚（苯乙烯磺酸盐）钠盐标准品（分子量范围891–258,000 g/mol）。

**结果**
**E. globulus的水有机热处理以溶解木质素**
原始E. globulus混合残渣的化学组成（基于干物质）如下（wt%）：葡聚糖41.5 ± 1.8，木聚糖15.9 ± 0.9，阿拉伯聚糖0.4 ± 0.1，半乳聚糖0.6 ± 0.1，甘露聚糖0.9 ± 0.1，乙酰基4.0 ± 0.2，酸不溶性木质素24.7 ± 1.3，酸溶性木质素2.9 ± 0.3，灰分2.1 ± 0.1，提取物（在绝对乙醇中）1.7 ± 0.1，蛋白质2.3 ± 0.1，其他3.0%，与文献中的数据基本一致（Viola等人，2021年）。高多糖含量使得这种残渣生物质成为开发基于单糖生产平台化学品的生物精炼方案的宝贵原料（Pandey和Sharma，2024年）。

根据文献，纯咪唑可以溶解木质素，产生富含纤维素和半纤维素的固体残渣，然后可以通过酶水解进一步分解为单体糖（Morais等人，2016年；Valladares-Diestra等人，2023年）。在本研究中，探讨了使用25%和35%重量百分比的咪唑水溶液在120°C、90°C和60°C下对生物质进行1小时、2小时和3小时的预处理，生物质负载量为9%。采用的实验方案见表1，其中列出了每个反应在木质素溶解和葡聚糖及木聚糖去除方面的主要结果。

**最佳反应条件下的木质素化学组成**
在最佳反应条件（咪唑35 wt%，T = 120°C，时间 = 2小时）下回收的脱木质素固体残渣（57.8 wt%）由55.9 wt%的葡聚糖、19.4 wt%的木聚糖、16.1 wt%的木质素、3.5 wt%的乙酰基、1.9 wt%的灰分、2.3 wt%的蛋白质和0.9 wt%的其他成分组成（补充表S1）。主要成分见表2，并与文献中报道的使用纯咪唑预处理的富含多糖的固体的化学组成进行了比较。

**预处理固体的酶糖化**
还研究了生物质负载量（10%、15%和20%）和酶剂量（15、25和35 FPU/g葡聚糖）对糖产量和浓度的影响，以找到最佳反应条件。表3显示了实施的实验方案，以及48小时后葡萄糖和木糖的产量和总糖浓度作为响应变量。图1显示了在不同反应条件下的葡萄糖和木糖产量的动力学。

**可溶性木质素的回收及其物理化学表征**
在优化的水有机热处理条件（咪唑35 wt%，T = 120°C，时间 = 2小时）下获得的可溶性木质素，通过酸化溶液（pH = 2）并离心去除咪唑和硫酸盐后沉淀，洗涤以去除杂质，干燥，并按以下方法进行表征。固体木质素约占回收木质素的95%，证实了所提出方法的效率。为了确认分离出的木质素的纯度和质量，使用标准NREL方法确定了其化学组成。它由以下成分组成（wt%）：0.3 ± 0.1葡聚糖，0.2 ± 0.1木聚糖，86.5 ± 1.1酸不溶性木质素，6.7 ± 0.9酸溶性木质素，2.2 ± 0.2灰分，1.5 ± 0.1蛋白质，2.6其他成分。

**ATR-FTIR光谱**
图2显示了从稀咪唑脱木质素过程中回收的木质素的ATR-FTIR光谱。
图2中3390 cm?1处的峰是由于木质素中典型的脂肪族和芳香族羟基的伸缩引起的。2926、2842和1460 cm?1处的信号是-CH3-和-CH2-基团中C-H键伸缩的特征。此外，样品还显示了芳香骨架的特征峰，如1600 cm?1（芳香环中C=C键的伸缩），1514和1424 cm?1（与C-H键的平面变形相关的芳香骨架振动）（Tavares等人，2022年）。丁香基单元的特征峰位于1324和1114 cm?1，而愈创木酸单元的特征峰位于1514和1214 cm?1。另外，1706 cm?1处的信号是未共轭酮、羰基和酯中C=O键伸缩的特征，1032 cm?1处的峰与纤维素吡喃环中的C–O–C键伸缩相关（Romaní等人，2016年）。这个峰的相对较低强度与木质素组成中葡聚糖含量较少一致。

**热重分析**
图3显示了在最佳反应条件下回收的纯木质素的TGA和导数热重（DTG）曲线。
图3中黑线表示分离木质素在TGA过程中的重量损失曲线。蓝线表示同一样品的计算DTG曲线。

**木质素的DTG曲线**
木质素在DTG曲线中显示出三个主要峰。第一个峰位于30–130°C范围内，质量损失为4.3%，与脱水现象相关。第二个降解峰（对应于大约31%的质量损失）位于130–330°C范围内，Tmax约为300°C。最后一个峰（对应于大约59%的质量损失）位于330–540°C范围内，Tmax为480°C，并在440°C处有一个肩峰。第一个脱水峰之后的峰，从低温度到高温度，分别与β-O-4键、C–C键和β-β键的断裂以及缩合和聚合反应相关（El Moustaqim等人，2018年）。β-O-4键断裂对应的峰的分辨率和强度取决于这些键在木质素中的相对丰度。富含这些键的木质素在200–300°C区域显示出明显的峰，如图3中本研究中分离的木质素所示。此外，300–500°C区域的峰分别对应于C–C键和β-β键的断裂，证实了纯木质素的典型结构。

**元素分析**
来自E. globulus的纯木质素的元素分析显示以下元素组成（基于干物质的wt%）：碳63.81 ± 0.16，氢6.17 ± 0.08，氮0.24 ± 0.06，硫0.15 ± 0.03，氧27.43 ± 0.33（根据材料与方法部分中的方程式6计算，考虑到灰分含量为2.2 wt%）。该材料的HHV使用方程式7计算得出，为26.7 MJ/kg。

**分子量测定**
补充图S1显示了实验获得的GPC色谱图。数均分子量（Mn）为1003.3 g/mol，而重均分子量（Mw）为2448.65 g/mol。多分散指数（作为Mw和Mn的比率计算）为2.4，表明木质素链的分布较为狭窄。

**讨论**
在这项工作中，测试了一种创新的水有机热处理方法，以优化E. globulus残渣的完全利用，使用水基咪唑溶液在相对温和的温度和溶剂消耗条件下进行。这种方法比基于纯咪唑的方法更环保，目的是获得纯的可溶性木质素和富含宝贵多糖的固体残渣，其特征是解构的木质纤维素基质。后者预计比原始生物质更容易进行酶水解，从而产生葡萄糖和木糖。

**木质素生产**
本实验矩阵的主要目标是找到适当的反应条件，以最大化木质素的溶解度，同时最小化生物质中主要多糖（即纤维素和半纤维素）的溶解度。根据表1中报告的实验结果，随着咪唑浓度、温度和反应时间的增加，木质素的溶解度增加。多糖的溶解度主要受到温度和咪唑浓度增加的促进。特别是比较条目1–3、4–6、7–9、10–12、13–15和16–18时，木质素的溶解度在1到2小时内略有增加，而在3小时内显著增加。对于葡聚糖和木聚糖的去除也观察到了类似的趋势，尽管差异不如脱木质素那么明显。从条目1、4和7（1小时）或2、5和8（2小时）或3、6和9（3小时）的比较来看，使用25 wt%的咪唑溶液时，温度对木质素溶解度的影响在3小时的过程持续时间更为明显。

对于35 wt%的咪唑溶液，比较条目10、13和16（1小时），11、14和17（2小时）或12、15和18（3小时）也观察到了类似的趋势。最后，通过比较条目1–3与10–12（60°C），4–6与13–15（90°C），以及7–9与16–18（120°C），展示了咪唑浓度对木质素和多糖溶解度的影响。将咪唑浓度从25%增加到35%对60°C和90°C下的生物聚合物溶解度影响不大，但在120°C时显著增加了木质素的去除率，达到75 wt%。相比之下，葡聚糖（从24%增加到31%，条目9和18）和木聚糖（从28%增加到38%，条目9和18）的去除率有所增加。表1中列出的水有机提取后剩余的固体残渣的回收及其完整的化学组成可以在补充表S1中找到。

**先前基于纯咪唑热处理的文献研究**
基于使用纯咪唑的热处理表明，这种有机碱可以改变纤维素的结构，导致从I型纤维素转变为II型纤维素，后者结晶度较低且更易溶解（Morais等人，2016年；Valladares-Diestra等人，2023年）。经历这种转变的纤维素比例可能随着咪唑浓度的增加而增加。

在条目18中报告的反应条件下，实现了最高的木质素溶解度（75 wt%），但同时不希望地显著去除了葡聚糖和木聚糖，而这些成分应保留在固体残渣中以供后续步骤利用。因此，木质素溶解度和多糖去除之间的最佳折中方案是条目17（咪唑35 wt%，T = 120°C，时间 = 2小时），其中实现了66 wt%的木质素去除率，同时葡聚糖和木聚糖的溶解度有限。选择这一折中条件是与文献中报道的木质纤维素生物质糖生产的技术经济和环境分析相一致的（Baral等人，2021年）。根据这项分析，在预处理步骤中，木质素的去除率应高于65 wt%，葡聚糖的去除率应低于15 wt%，木聚糖的去除率应低于35 wt%。所获得的结果为在温和条件下提高脱木质素过程的可持续性提供了具体的视角，并有助于推进木质纤维素生物质利用领域的技术知识和科学理解，因为在比基于纯咪唑的文献研究更温和和更可持续的反应条件下，实现了更高的脱木质素程度和有限的多糖去除率。科学文献中只有少数研究基于使用咪唑对生物质进行预处理，在所有情况下，咪唑都是作为纯溶剂使用的，而不是像本研究中那样以溶液形式使用（Morais等人，2016年；Pereira等人，2021a年；Sayury Nishida等人，2021年；Valladares-Diestra等人，2023年）。在之前的研究中，反应在110–180°C的温度范围内进行，反应时间为1–4小时，生物质负载量为9–10 wt%。在所有情况下，反应结束后，反应器被冷却至90°C（以保持咪唑为液态），然后加入去离子水，悬浮液搅拌1小时，然后过滤以回收固体生物质。相比之下，在本研究中，使用咪唑的水溶液减少了有机溶剂的消耗，从而降低了所提出过程的环境影响。实际上，使用35 wt%的咪唑溶液显著节省了试剂，这也意味着过程的经济可行性得到了提高。此外，使用稀释的咪唑水溶液使得温度可以降低到甚至低于咪唑的熔点（例如，在本工作中低至60°C），从而实现了节能的方法。

Morais等人（2016年）在110至170°C的温度范围内，使用纯咪唑对小麦秸秆进行了预处理，处理时间为1至4小时。他们证明，在优化的反应条件（170°C，2小时，生物质负载量为9 wt%）下，木质素的去除率达到80 wt%，得到了富含多糖的固体残渣。Morais及其同事相比本工作实现的略微更高的脱木质素程度是由于使用了高50°C的温度以及100 wt%的咪唑。使用更高的温度导致了更高的能耗，因此也导致了更高的过程成本。同样，Valladares-Diestra等人（2023年）使用纯咪唑对四种不同的生物质类型进行了预处理，分别是油棕空果串、甘蔗渣、大豆壳和可可豆荚壳，这些生物质含有不同的木质素含量。在每种生物质的优化反应条件下（油棕空果串为180°C，1小时；甘蔗渣为160°C，1小时；大豆壳为120°C，1小时；可可豆荚壳为180°C，2小时），木质素的去除率约为70 wt%，与本研究中获得的值一致。

使用纯咪唑的预处理在几种初始化学组成非常不同的生物质上进行了测试，证明了这种有机溶剂的显著多功能性和有效性。这是扩大生物精炼过程规模的一个基本特征，因为随着时间的推移，可以使用不同性质的生物质，确保所提出的转化过程具有相同的性能。如表2所示，从新的水-有机-热处理过程中获得的固体残渣中的葡聚糖、木聚糖和木质素含量与文献中报道的基于纯咪唑预处理的富含多糖的固体中的含量一致。本工作中获得的葡聚糖和木聚糖含量略低于其相应区间的最大值。相比之下，木质素含量处于中间范围，证实了获得的固体残渣具有适合进一步化学和/或生物催化增值的组成，由于使用了较低的温度（120°C而不是典型的160–180°C），从而将有机溶剂的消耗减少了三分之二，并降低了过程能源成本。

分离出的木质素的化学组成证实了其非常高的纯度（固体中占93.2 wt%），为这种芳香族生物聚合物的各种有价值的应用铺平了道路。这种化学组成与文献中报道的典型有机溶剂木质素一致（Ba?ak??lardan Kabakc?和Tan??，2021年）。关于获得的木质素的质量，由于蛋白质的存在（1.5 wt%），氮含量低，证实了分离出的木质素中不含大量的咪唑，这证实了用于选择性收集溶解木质素的离心和洗涤方法的有效性。低硫含量也证实了在基于咪唑的水-有机-热处理原始生物质后，使用H2SO4将pH值降至2以促进木质素沉淀的过程中没有产生大量的硫酸盐。获得的元素组成与文献中报道的主要商业木质素类型一致，包括Kraft木质素、Indulin? AT、Soda Protobind? 1000和Alcell?有机溶剂木质素（Constant等人，2016年）。

适合直接燃烧用于能源生产的生物质、生物质残渣和木质素的典型HHV值范围为20至35 MJ/kg。因此，纯木质素获得的HHV证实了其直接用于能源应用的潜力（Di Fidio等人，2024年）。或者，所提出的生物精炼方案中回收的木质素可以用作生产表面活性剂和水凝胶的原料（Sethupathy等人，2022年），或者可以通过酶促（Reshmy等人，2022年）或化学（Lu等人，2020年）催化作用将其降解为芳香族化合物。多分散性指数Mn和Mw值与文献中报道的商业木质素一致（Constant等人，2016年）。

为了评估整个过程的有效性，需要通过评估生物质的酶促水解能力来整合脱木质素的程度，这也是基本的。在这个范围内，水-有机-热处理的适用性是根据随后酶促水解测试中的单糖（葡萄糖和木糖）产量来评估的。影响酶促水解的因素包括：i）生物质的孔隙率；ii）纤维素的结晶相类型；iii）纤维素和半纤维素的聚合程度；iv）后者的结晶度；v）存在的木质素量（Zhao等人，2012年）。Cellic? CTec3 HS酶混合物被用于水解测试。这种酶混合物代表了工业上使用的一种最新和最先进的酶制剂，因为它具有高酶活性，并且酶组成针对木质纤维素生物质的水解进行了优化（Sun等人，2015年）。然而，这种酶混合物对半纤维素的水解活性低于Cellic? CTec2，因为Cellic? CTec3 HS仅含有木聚糖1,4-β-木糖苷酶，该酶通过从非还原末端去除连续的D-木糖残基来催化（14)-β-D-木糖的水解反应（Sun等人，2015年）。基于此，并考虑到预处理生物质中不可忽视的木聚糖量（约20 wt%），向酶混合物中添加了来自T. viride的内切-1,4-β-木糖苷酶，以提高生物催化剂的水解活性。

为了降低所提出的生物精炼过程的成本，测试了相对较低的酶剂量，因为酶的成本通常占生物精炼过程总成本的约20%（Gomes等人，2020年）。此外，为了考虑所设计的多阶段过程可能的工业发展，研究了将水解反应中的生物质负载量增加到15或20 wt%（高重力方法），以获得更富含单糖的水解产物。在所有测试开始和结束时测量了pH值，并保持恒定。这一观察结果，加上上述的ATR-FTIR光谱和元素分析，表明预处理后的固体残渣中不含咪唑，因此每次预处理后用水洗涤是有效的。

如表3和图1所示，增加酶剂量有利于提高每种生物质负载量的葡萄糖和木糖产量。增加生物质负载量显著降低了糖的产量，但将水解物中的总糖浓度提高到了使用15 wt%的生物质负载量和35 FPU/g葡聚糖的Cellic? CTec3 HS剂量时获得的最大值116.5 g/L（表3中的条目24）。然而，在这些反应条件下，葡萄糖产量为79.0 mol%，木糖产量为77.2 mol%。这些值显著低于表3中的条目20和21获得的值，在那些条目中几乎实现了多糖的完全转化。为了减少所提出的生物精炼过程的副产物并最大化所选可再生资源的利用，在条目20中获得了最佳结果（生物质负载量=10 wt%，Cellic? CTec3 HS=25 FPU/g葡聚糖），这是在葡萄糖和木糖产量、总糖浓度以及酶消耗之间的一种折中。

此外，为了证明预处理在后续糖化过程中获得高产量的重要性，进行了一项对照测试，即在优化反应条件下对原始E. globulus进行酶促水解（表3中的条目28）。正如预期的那样，葡萄糖和木糖的产量极低，这证实了创新的水-有机-热处理在后续糖化过程中的基本作用。

如表2所报告的，只有少数研究调查了使用纯咪唑对各种生物质的预处理，但尚未有研究调查基于咪唑的水-有机-热处理对木质纤维素生物质后续糖化过程效率的影响。在Pereira等人（2021a,b）的两项研究中，小麦秸秆和桉树残渣在160°C下用纯咪唑预处理4小时，Cupressus lusitanica在145°C下预处理3小时后，富含多糖的固体残渣在商业酶混合物Cellic? CTec2的存在下进行了酶促水解，即比本工作中使用的混合物更早的版本。在采用的反应条件下（生物质负载量仅为2 wt%，酶剂量为60 FPU/g葡聚糖，72小时），小麦秸秆、桉树和C. lusitanica的葡萄糖产量分别为93、38和31 mol%，而木糖产量分别为77、40和19 mol%。除了小麦秸秆的葡萄糖产量外，这些糖产量显著低于本工作中的产量，本工作中的产量是基于五倍更高的生物质负载量（10 wt%而不是2 wt%）和42%的酶剂量（25 FPU/g葡聚糖而不是60 FPU/g葡聚糖）。

在Valladares-Diestra等人（2023）的研究中，甘蔗渣、大豆壳、可可豆荚壳和油棕空果串接受了咪唑预处理，然后使用Cellic? CTec2酶进行了酶促水解。在这种情况下，糖化过程中也使用了非常低的生物质负载量2 wt%，并且酶剂量为20 FPU/g葡聚糖。获得的葡萄糖产量分别为97、100、87和92 mol%，这些值与本工作中的结果相当。然而，这些高产量是在非常低的生物质负载量下获得的，这不适合可能的工艺放大，因为获得的水解物糖浓度低，不利于下游操作和后续的催化升级过程，如发酵。

Morais等人（2016年）在170°C、2小时、9 wt%的生物质负载量下对小麦秸秆进行了脱木质素处理。预处理的固体残渣使用两种商业酶Celluclast? 1.5L和β-葡萄糖苷酶Novozym 188的混合物进行了72小时的酶促水解，生物质负载量为10 wt%，获得了99和81 mol%的葡萄糖和木糖产量，相应的总糖浓度为84.7 g/L。这些结果与本研究获得的结果相似，不过在本研究中还有一个额外的优势，即减少了预处理阶段使用的咪唑的量。关于本研究中使用的Cellic? CTec3 HS酶混合物的效率，文献中只有少数研究使用了这种新的商业产品，而将Cellic? CTec3 HS与T. viride来源的endo-1,4-β-木聚糖酶结合使用则是本研究首次提出的。在之前的文献研究中，不同的生物质经历了不同的预处理过程。特别是Kim等人（2019年）对经过蒸汽爆炸预处理（190°C，15分钟）的空果穗进行了酶水解，使用固体负载量在20%到30%之间，酶剂量在20到60 FPU/g葡聚糖之间，在优化条件下（20%固体负载量，60 FPU/g葡聚糖）获得了99%的葡萄糖产率。然而，在热液预处理后的残渣中，起始生物质中超过65%的半纤维素丢失，阻碍了其利用。相比之下，在本研究中，所提出的水有机热处理仅使30%的半纤维素溶解，提高了起始材料的利用率。Fockink等人（2017年）对蒸汽爆炸处理的甘蔗渣（195°C，7.5分钟）进行了酶水解，改变了酶剂量在7到40 FPU/g葡聚糖之间，生物质负载量在10到20%之间。在最佳反应条件下（38.6 FPU/g葡聚糖，生物质负载量10%，72小时），获得了99%的葡萄糖产率，相应的总糖浓度为120 g/L。这个数值和本研究中获得的数值都远高于Gomes等人（2020年）的结果，他们使用相同的酶混合物对甘蔗渣进行了处理（8.5 FPU/g葡聚糖，2%底物负载量），甘蔗渣先用柠檬酸水溶液（柠檬酸浓度6%）预处理，然后在90°C下处理1.5小时，总糖浓度仅为28 g/L。

图4展示了所提出的生物精炼厂模型的质量平衡流程图。从1公斤的E. globulus混合残渣开始，经过稀咪唑基水有机热处理（120°C，2小时，生物质负载量9%，400转/分钟）后回收的固体残渣占起始原始生物质的57.8%。这种固体残渣主要由有价值的多糖（葡聚糖和木聚糖）组成，占干物质的75.3%，木质素含量较低，为16%。液体部分含有0.183公斤的木质素，相当于原始生物质中木质素的约66%。在酸性环境中沉淀木质素并回收清洗后，固体残渣为0.174公斤（可溶性木质素的95.1%），含有93.2%的木质素和其他成分（如葡聚糖、木聚糖、蛋白质和灰分）的量可以忽略不计。富含糖的固体残渣被用作后续糖化步骤的原料，使用了商业酶混合物Cellic? CTec3 HS，并添加了T. viride来源的endo-1,4-β-木聚糖酶。在最佳反应条件下（生物质负载量=10%，Cellic? CTec3 HS=25 FPU/g葡聚糖+10 IU endo-1,4-β-木聚糖酶/g木聚糖，48小时，200转/分钟，pH 4.8），葡聚糖和木聚糖几乎完全转化为葡萄糖和木糖，每5.2升溶液产生0.353公斤葡萄糖和0.117公斤木糖（葡萄糖浓度68.0 g/L，木糖浓度22.5 g/L）。根据这个质量平衡，从1.0公斤的干木质纤维素残渣中获得了174克纯木质素、353克葡萄糖和117克木糖，总计0.64公斤。这些结果与文献中报道的基于第一步使用纯咪唑和第二步酶水解的生物精炼厂模型的质量平衡流程图一致（Sayury Nishida等人2021年；Valladares-Diestra等人2022年；Zevallos Torres等人2023年）。

从1公斤的E. globulus混合残渣开始，经过稀咪唑基水有机热处理（120°C，2小时，生物质负载量9%，400转/分钟）后回收的固体残渣占起始原始生物质的57.8%。这种固体残渣主要由有价值的多糖（葡聚糖和木聚糖）组成，占干物质的75.3%，木质素含量较低，为16%。液体部分含有0.183公斤的木质素，相当于原始生物质中木质素的约66%。在酸性环境中沉淀木质素并回收清洗后，固体残渣为0.174公斤（可溶性木质素的95.1%），含有93.2%的木质素和其他成分（如葡聚糖、木聚糖、蛋白质和灰分）的量可以忽略不计。富含糖的固体残渣被用作后续糖化步骤的原料，使用了商业酶混合物Cellic? CTec3 HS，并添加了T. viride来源的endo-1,4-β-木聚糖酶。在最佳反应条件下（生物质负载量=10%，Cellic? CTec3 HS=25 FPU/g葡聚糖+10 IU endo-1,4-β-木聚糖酶/g木聚糖，48小时，200转/分钟，pH 4.8），葡聚糖和木聚糖几乎完全转化为葡萄糖和木糖，每5.2升溶液产生0.353公斤葡萄糖和0.117公斤木糖（葡萄糖浓度68.0 g/L，木糖浓度22.5 g/L）。基于这个质量平衡，从1.0公斤的干木质纤维素残渣中获得了174克纯木质素、353克葡萄糖和117克木糖，总计0.64公斤。这些结果与文献中报道的基于第一步使用纯咪唑和第二步酶水解的生物精炼厂模型的质量平衡流程图一致。

实验室规模的木质纤维素分离过程通常表现出相对较高的E因子，因为它们包含大量的洗涤和溶剂处理步骤，这些步骤尚未通过溶剂回收或逆流操作进行优化（Sheldon 2007年；Clark等人2009年）。根据1000克E. globulus残渣的实验质量平衡（图4），所需产品的总量为174克纯木质素和470克单糖（353克葡萄糖和117克木糖），总计644克可利用产品。当木质素和单糖都被视为可利用产品时，所需产品的总量为644克（174克木质素和470克糖）。在这种情况下，废物质量包括残余固体（约200克）、用于木质素纯化的丙酮（1600克）、用于沉淀的硫酸（约200克）以及洗涤过程中产生的浓缩水流出物（约5500克）。假设这种情况，总废物量约为7500克，估计的E因子为11.6。这个数值突显了当木质素和碳水化合物组分都被完全利用时所实现的材料效率的提高，而不是将木质素作为单一产品处理。如果将酶水解过程中使用的水介质也计入计算，废物质量将进一步增加。据估计，与水解相关的工艺用水量为5000克，糖浓度为91 g/L，总废物量增加到约12,500克，相应的E因子为19.4。这一增加反映了水介质对材料效率的影响，特别是在实验室规模上，溶剂和水的消耗尚未通过回收或工艺强化策略进行优化。因此，本研究中报告的12-20范围是一个保守的估计，反映了实验室实践，同时避免了将所有工艺用水都视为不可回收废物的过度估计。这些结果表明，在这个发展阶段，水介质是材料足迹的主要贡献者，并表明实施水回收策略可以在工业条件下进一步降低有效的E因子。除了E因子外，还使用活性溶剂强度（ASI）指标来评估溶剂的效率，该指标定义为每单位质量提取的木质素所使用的活性溶剂的质量。从绿色化学的角度来看，使用水中的稀释咪唑显著提高了溶剂利用效率。当按去除的木质素量标准化后，ASI比基于纯咪唑系统的文献报告降低了约65%，同时保持了类似的脱木质素程度（约70%）（Nishida等人2021年；Valladares-Diestra等人2023年）。值得注意的是，引入水作为低影响共溶剂并未影响提取性能，但显著减少了有机组分的消耗。最后，所采用的操作条件（120°C，大气压，水介质，低促进剂浓度）被认为是温和的，因为它们比传统酸性或碱性预处理所需的条件要温和得多。

基于这些因素，所提出过程的可持续性应该从比较和过程导向的角度来考虑，包括：（i）高碳效率；（ii）通过降低ASI证明的溶剂效率提高；以及（iii）提取的木质素和富含碳水化合物的固体的充分利用，导致固体废物的产生最小化，E因子相对较低。总之，基于木质素优先方法的新水有机热处理得到了优化，实现了E. globulus混合残渣（树枝、树皮和叶子）的完全循环利用，生产出纯木质素和富含糖的糖浆。原始木质纤维素生物质在温和的反应条件下（120°C，2小时，9%生物质负载量）使用稀水咪唑溶液（35%）进行了脱木质素处理，以选择性地溶解木质素并获得富含多糖的固体材料。研究了咪唑浓度和反应时间对木质素、葡聚糖和木聚糖去除的影响。在最佳反应条件下，木质素的溶解率为原始生物质中含量的66%，固体残渣约占58%。这种固体残渣由56%的葡聚糖、19%的木聚糖和16.1%的木质素组成，证实了有价值糖分的富集。然后，在新的酶混合物存在下进行了酶水解，该混合物使用了Cellic? CTec3 HS并添加了T. viride来源的endo-1,4-β-木聚糖酶。研究了生物质负载量（10%、15%和25%）和酶剂量（15、25和35 FPU/g葡聚糖）对葡萄糖和木糖产率的影响。在最佳反应条件下（10%生物质负载量，25 FPU/g葡聚糖，48小时），葡萄糖和木糖的产率分别为98.5摩尔%和92摩尔%。获得了约90 g/L总还原糖的糖浆，这代表了通过化学和/或生物途径进一步催化升级为高价值化合物的有希望的原料。最后，这种不可食用生物质的不同组分的完全和定制分离及转化代表了开发绿色和可持续生物精炼过程的一个进步。