开发了一种高通量、无标记的方法，利用皮升级琼脂糖珠富集抗代谢物酵母菌株

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Development of a high-throughput label-free method for enrichment of antimetabolite-resistant yeast strains using pico-litre agarose beads

　　摘要
抗代谢物是代谢物或碳源的结构类似物，通过干扰代谢过程表现出毒性。它们可以将感兴趣的表型与生长联系起来，从而有助于从随机突变产生的大量突变池中筛选出相关菌株。许多抗代谢物的毒性和高昂成本促使人们在培养过程中尽量减少液体体积，同时仍能捕获大量突变池中的遗传多样性。本研究旨在探索基于高通量微珠的培养技术和无标记富集方法，用于筛选抗抗代谢物的突变体。利用水包油乳液生成大量（约10^7个）皮升级的培养微珠，可以在总共0.3毫升的培养基体积内实现数百万个单个突变体的高通量并行生长。减少筛选培养基的体积可以降低所需昂贵抗代谢物的用量。通过采用荧光激活的微珠分选方法，可以根据自荧光信号无标记地筛选和选择突变体。通过单步富集实验，该方法分别将G418（遗传霉素）抗性和葡萄糖类似物（2-脱氧葡萄糖）抗性的酿酒酵母菌株富集了16,000倍和600倍，证明了其潜力。

关键点
• 小体积培养降低了昂贵抗代谢物抗性筛选的成本。
• 基于自荧光的筛选方法实现了抗性突变体的无标记检测。
• 抗抗生素和葡萄糖类似物菌株分别被富集了10^4倍和10^3倍。

引言
由于高通量筛选技术的应用，传统菌株改良的效率显著提高（Zhou和Alper 2019；van Tatenhove-Pel等人2020；Zeng等人2020）。传统菌株改良包括随机突变后进行突变体筛选。当由于对相关基因了解有限、缺乏基因工程工具或需要筛选复杂的多基因表型（如耐受性）时，这种方法尤为重要。对于食品发酵行业而言，监管和/或公众接受度问题限制了靶向基因工程的应用（Marshall 2026；Bachmann等人2015；Marsit和Dequin 2015）。
传统菌株改良通常包括两个关键步骤：（i）通过随机突变产生遗传多样性，（ii）通过筛选或选择分离出改良的变体（Zhou和Alper 2019；Zeng等人2020）。随机突变要求使用高通量筛选方法，以便从大量突变池中识别、选择和富集具有所需表型的突变体（Zeng等人2020）。当相关表型可以与生长联系起来时，更高的特定生长率和/或存活率可以使感兴趣的突变体在繁殖过程中占据优势。对于某些表型（如改善的生长耦合分解产物生成率和对环境压力因子的耐受性），适应性实验室进化提供了一种基于生长的直接筛选方法（Bachmann等人2015；Mans等人2018；Zeng等人2020）。对于产生更高滴度、生产力或非生长耦合同化产物的突变体，采用生长耦合筛选则更具挑战性（Mans等人2018）。实施生长耦合策略的挑战也使得筛选具有失调分解代谢物抑制的菌株变得复杂，而这在工业生物技术中非常重要。抗代谢物是一类与天然代谢物结构高度相似的化合物，会干扰野生型细胞的代谢或调控机制（Adrio和Demain 2006；Fiedurek等人2017；Cardoso等人2018）。抗代谢物的抗性已被广泛用于筛选改进的非生长耦合产物合成和缓解分解代谢物抑制（Adrio和Demain 2006；Fiedurek等人2017；Cardoso等人2018）。在许多合成产物途径中，途径中的一个或多个酶受到产物或下游中间体的反馈抑制（Adrio和Demain 2006；Fiedurek等人2017）。为了克服这种反馈抑制并促进产物积累，一种有效的方法是通过选择对抗代谢物具有耐受性的菌株来使目标酶对反馈抑制不敏感，这些抗代谢物模拟了天然抑制剂（Adrio和Demain 2006；Fiedurek等人2017）。对抗代谢物具有耐受性的突变体通常也对天然抑制剂不敏感，因此能够积累产物，而非耐受性突变体则无法存活。因此，抗抗代谢物的能力提供了一种有效的生长/非生长筛选策略。
抗代谢物还可以用于缓解分解代谢物抑制。例如，葡萄糖的抑制是阻止原料（如木质纤维素水解物）中多种糖同时转化的关键因素（Jung等人2015；Gao等人2019；Fox和Prather 2020；Shrestha等人2023）。通过在另一种碳源存在下选择对抗代谢物2-脱氧葡萄糖（一种第二碳位没有羟基的葡萄糖类似物）的耐受性，可以获得抗分解代谢物（葡萄糖）抑制的酿酒酵母突变体（Neigeborn和Carlson 1987；McCartney等人2014a；Soncini等人2020）。类似的策略也被用于调节氮源和磷酸源的抑制，以改善次级代谢物（如抗生素）的生产（Adrio和Demain 2006；Fiedurek等人2017）。
在选择抗抗代谢物突变体时，空间分离突变体可以保持突变池的遗传多样性。如果所有突变体都在一个培养室中生长，生长最快的突变体会淘汰生长较慢的突变体，从而使单一基因型可能主导整个群体。通过空间分离单个突变体，消除了基于生长的竞争，保留了感兴趣的突变体的多样性并使其能够被筛选。这种空间分离可以通过在固体培养基上分离菌落形成单位来实现。然而，这种方法需要大量的培养基和实验室消耗品，以及大量的抗代谢物。许多抗代谢物价格昂贵且对人体有毒。将筛选过程微型化到微孔板中，并结合使用液体处理机器人技术，可以提高筛选效率，但仍不足以覆盖大规模突变池的需求（Zeng等人2020）。
水包油乳液中的琼脂糖微珠含有大量皮升级的培养微室（约10^7个微珠），仅需0.3毫升的培养基（van Tatenhove-Pel等人2020；Zeng等人2020；Zhou和Alper 2019）。本研究旨在探讨这种多并行培养方法在从大量细胞群体中筛选抗抗代谢物突变体同时最小化总培养体积的潜力。当每个含有抗代谢物的微珠接种一个细胞时，只有接种了抗抗代谢物抗性细胞的微珠才会显示生长。然后可以通过（自动）荧光激活的微珠分选方法选择出具有抗抗代谢物能力的突变体，从而实现无标记富集——这与大多数现有的基于微滴的筛选方法不同，后者依赖于基因工程荧光标记（van Tatenhove-Pel等人2020）。微珠培养与微珠分选的结合应该能够在使用最少量的昂贵和有毒抗代谢物的情况下，对数百万个突变体进行无标记筛选。此外，由于微珠接种的是单个细胞，因此可以完全捕获突变体群体的遗传多样性。为了测试这种方法，我们开发了一种基于微珠的无标记方法，用于从敏感的酿酒酵母菌株群体中富集抗抗代谢物的酿酒酵母菌株。我们通过富集G418（遗传霉素）和2-脱氧葡萄糖（葡萄糖抗代谢物）抗性的酿酒酵母菌株来验证该方法。

材料与方法
本研究中使用的菌株、培养基和酿酒酵母菌株分别列于表S2（补充部分2）和表1中。质粒在大肠杆菌XL1-Blue细胞（Agilent，加州圣克拉拉）中扩增。为了长期储存于-80°C，向处于后期指数期的酿酒酵母培养物和大肠杆菌培养物中分别添加甘油，最终浓度达到30%（v/v）和25%（v/v）。表1列出了本研究中使用的酿酒酵母菌株。
大肠杆菌培养物在含有100 μg/L氨苄西林的LB培养基中于37°C培养以维持质粒。酿酒酵母菌株在500毫升或100毫升圆底烧瓶中以200 rpm的速度在Innova培养箱（New Brunswick Scientific，新泽西州爱迪生）中培养18小时。酿酒酵母菌株分别在含有100毫升或20毫升培养基的500毫升或100毫升烧瓶中培养。酿酒酵母菌株还在适用于高细胞浓度培养的合成培养基（HCSM）中培养。HCSM的制备方法如Castrillo等人（1996）所述，但不含消泡剂，并用9 g/L尿素替代(NH4)2SO4。预培养物在含有20 g/L葡萄糖的YP培养基中培养。HCYP和HCSM分别补充了80 g/L葡萄糖和80 g/L蔗糖。当使用kanMX进行筛选时，向HCYP培养基中添加50至600 μg/mL的灭菌G418（遗传霉素）。尽管化学定义的培养基（HCSM）更受欢迎，但由于G418敏感菌株在该培养基中的生长受到抑制，因此未用于G418的选择。这种抑制可能是由于培养基中钾和镁盐的高浓度造成的。当使用2-脱氧葡萄糖进行筛选时，向HCSM培养基中添加0.25至8 mg/mL的灭菌2-脱氧葡萄糖。固体培养基平板含有2%（w/v）琼脂。

分子生物学技术和菌株构建
质粒使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit（Thermo Fisher Scientific）从大肠杆菌中分离。酿酒酵母的基因组DNA的分离方法如L?oke等人（2011）所述。DNA扩增使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶（Termo Fisher Scientifc，马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行克隆，使用DreamTaq PCR Mastermix（Termo Fisher Scientifc）进行诊断PCR。从PCR反应混合物中分离DNA片段使用GeneJET PCR Purifcation Kit（Termo Fisher Scientifc）。DNA片段通过1%琼脂糖TAE凝胶在100 V电压下电泳30分钟进行分离和可视化。从凝胶中切下的DNA片段使用Zymoclean Gel DNA recovery Kit（Baseclear）纯化。质粒的Gibson组装使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯威奇）进行，所得质粒在大肠杆菌XL1-Blue化学感受态细胞中扩增。酿酒酵母菌株的转化使用LiAC/ssDNA/PEG进行，方法如Gietz和Woods（2002）所述。转化后，按照Mans等人（2015）的方法去除gRNA质粒，并将单个菌落连续划线至少三次以确保纯系单细胞株。通过对抗分离出的基因组DNA进行诊断PCR来确认基因组插入。
表1和表S2分别显示了本研究中使用的菌株和质粒。在IMX2600中，通过引入pUDR371以及通过退火引物18,833和18,834（研究中使用的引物列在补充部分1）获得的双链DNA修复片段，得到了IMX2748菌株。使用引物20,226和20,227从质粒pUG6中扩增了kanMX整合盒。kanMX整合盒与质粒pUDR376一起被转入IMX2600和IMX2748，分别得到IMI575和IMI602。pGGKd016是通过使用Lee等人（2015）描述的Golden Gate反应协议组装部分质粒pYTK002、pYTK047、pYTK072、pYTK074和pYTK083构建的。质粒pUDE1242是通过使用引物对17,634和19,385、12,382以及14,776和17,008从pUDE1111、pUDC329和pGGKd016中PCR扩增的三个片段组装而成的。ymNeongreen整合盒使用引物19,247和19,248从pUDE1242中扩增。ymNeongreen整合盒与质粒pUDR538一起被转入IMX2600，得到IMX2871。ymNeongreen标记针对酵母进行了密码子优化，被认为是酿酒酵母中表现最好的荧光蛋白标记之一（基于体内亮度和光稳定性）（Botman等人2019）。

分析方法
使用Libra S11分光光度计（Biochrom，英国剑桥）在660 nm处测量光密度（OD）。细胞浓度使用BD Accuri? C6 Plus流式细胞仪（BD Biosciences，美国加州圣何塞）测量。使用Zeiss Axio Imager Z1（Carl Zeiss AG，德国耶拿）和AxioCam HRm Rev3探测器（60 N-C 1″×1.0）（Carl Zeiss AG）以及20倍侧向放大物镜确定油中琼脂糖微珠的大小和体积分布。关于平均微珠大小估算的详细信息见补充信息的第3节。

微珠的制备
油中的琼脂糖微珠的制备方法如van Tatenhove-Pel等人（2021）所述。乳液由水相和油相（Novec HFE 7500氟化油，3 M，明尼苏达州Maplewood）组成，其中含有0.2%的PicoSurf 1表面活性剂（Sphere Fluidics，英国剑桥）。水相中含有含有8%（重量/体积）葡萄糖的HCYP培养基或含有8%（重量/体积）蔗糖的HCSM，以及1%（重量/体积）琼脂糖（超低凝胶温度型IX-A，A2576，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。在需要时，水相中还添加了G418或2-脱氧葡萄糖以及酵母细胞。从预培养物中收集处于指数生长阶段的细胞（OD660值在4到10之间）。细胞经过离心（5分钟，3000×g），用无菌去矿物质水洗涤，之后测量细胞浓度（细胞/毫升）。将2.7×10^6个细胞稀释在300微升含有8%（重量/体积）蔗糖的HCSM或含有8%（重量/体积）葡萄糖的HCYP中，得到λ值为0.2（见补充材料第4节）。在这个λ值下，90%的接种微珠（不包括空微珠）包含一个细胞（见补充材料第4节）。为了考虑在制备微珠过程中细胞活力的损失，添加了所需细胞数量的两倍，以λ值为0.2进行接种。为了制备乳液，将300微升水相与700微升油相和表面活性剂混合，使用T10 basic ULTRA TURRAX均质器（IKA，德国施陶芬）以3的速度搅拌5分钟。使用两毫升圆底管（Eppendorf，德国汉堡）来制备和孵育乳液。乳液在室温下制备。用含有8%（重量/体积）葡萄糖的HCYP培养基制备的微珠平均体积为52.12皮升（见补充材料第3节）。用含有8%（重量/体积）葡萄糖的HCSM制备的微珠平均体积为47.40皮升（见补充材料第3节）。乳液在HulaMixer?样品混合器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上以30°C的温度和1转/分钟的轨道旋转速度孵育40小时。孵育后，向1毫升乳液中加入1.2毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）和1.5毫升全氟辛醇（PFO，Alfa Aesar，美国马萨诸塞州沃德希尔），轻轻混合，使微珠与水相（即PBS）分离，并用移液管小心回收。

在流式细胞术之前，通过40微米网筛（pluriStrainer，PET网）过滤去除大于40微米的微珠。随后测量小于40微米的微珠。使用488纳米激光在BD FACSAria? II SORP细胞分选仪（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）上测量前向散射、侧向散射和绿色荧光信号，该仪器配备有130微米喷嘴，并运行FACSFlow?软件（BD Biosciences）。绿色荧光信号通过545/28纳米或530/30纳米带通滤光片检测。在感兴趣的门控范围内，对96到384个事件进行分选，纯度精度为4倍，培养基为YP+2%葡萄糖。数据分析使用FlowJo? v10.10软件（BD Life Sciences）。所应用的门控策略在补充材料第5节中有详细描述。

为了评估富集效果，确定了接种物中以及微珠分选后菌株的相对丰度。通过流式细胞术测量荧光强度，确定了乳液培养物中S. cerevisiae菌株IMX2871和IMI575（荧光菌株和非荧光菌株）的相对丰度（记录了10^5个事件）。为了确定分选微珠后在磷酸盐缓冲盐水中不同菌株的比例，首先将微珠样品涡旋混合，然后将得到的悬浮液接种在含有2%葡萄糖（重量/体积）的YP固体培养基上。在30°C下孵育至少18小时后，使用Safe Imager 2.0蓝光透射仪（Invitrogen，美国马萨诸塞州）照射平板，计算两种菌株的相对丰度。

为了确定分选微珠前未标记抗性和非抗性菌株的相对比例，我们将混合物接种在含有2%（重量/体积）葡萄糖的YP固体培养基上，并使用G418作为选择标记（2-脱氧葡萄糖抗性菌株也经过G418抗性工程改造）。根据目标初始比例（从10^2分之1到10^4分之1不等），分别接种了10^4到10^6个细胞。用菌株混合物接种微珠，然后在含有2%（重量/体积）葡萄糖的YP固体培养基上分选生长出的微珠。所有来自含有2%（重量/体积）葡萄糖的YP固体培养基的菌落都在含有2%（重量/体积）葡萄糖和G418的YP固体培养基上评估生长情况。

为了无标记地鉴定抗性S. cerevisiae菌株，我们在含有G418的培养基中制备微珠，并接种对G418敏感的CEN.PK113-7D菌株和对G418抗性的IMI575菌株。G418是一种氨基糖苷类抗生素，可抑制蛋白质合成，常用于S. cerevisiae的选择标记（Wach等人，1994年）。对空微珠的流式细胞术分析显示了侧向散射和荧光信号的分布，这与它们的多分散性一致。微珠以λ值为0.2接种（见补充材料第4节），并在抗生素G418存在下孵育40小时。生长后，流式细胞术分析显示，与空微珠相比，接种了细胞的微珠含有额外的细胞群体（见图1a、c和d）。通过与对照样本比较（见图1b），确定这个群体为单细胞群体。单细胞群体可能来源于受损的微珠。对于接种了G418抗性菌株IMI575的微珠，检测到另一个具有更高荧光和侧向散射信号的群体（见图1d）。这个群体被鉴定为具有细胞生长的微珠，因为随着细胞生长，自荧光会增加，而这仅观察到了接种了抗性菌株的微珠（见图1d）。侧向散射信号的增加与细胞生长导致的微珠内部复杂性增加一致。

图1显示了流式细胞术群体对应于空微珠（a）、对G418敏感的S. cerevisiae菌株CEN.PK113-7D单细胞（b）、接种了G418敏感菌株的微珠（c）以及接种了G418抗性S. cerevisiae菌株IMI575的微珠（d）。微珠在含有G418的培养基中制备，以λ值为0.2接种，并孵育40小时。更多门控信息见补充材料第5节。

这些结果表明，可以使用自荧光和/或侧向散射作为生长指标来检测微珠中未标记抗性菌株的生长。所采用的一般门控策略的详细概述见补充材料第5节。

通过微珠分选富集表达荧光蛋白的S. cerevisiae细胞。为了验证所提出的富集方法对特定低丰度酵母菌株的有效性，使用了表达ymNeongreen的荧光菌株IMX2871和表达kanMX的抗G418的S. cerevisiae菌株IMI575的混合物。为了减少接种多个细胞的微珠数量，同时保持足够的接种微珠数量，微珠以λ值为0.2接种（见补充材料第4节）。正如预期的那样，生长后，流式细胞术显示接种了表达ymNeongreen的S. cerevisiae菌株IMX2871的微珠比接种了表达kanMX的参考菌株IMI575的微珠具有更高的荧光强度（见补充材料第5节）。接种了参考菌株的微珠的荧光信号归因于酵母细胞和用于生成微珠的琼脂糖基质的自荧光（Siano和Mutharasan 1989；Podrazky等人2003；Maslanka等人2018）。根据两种菌株的荧光强度，定义了一个FACS门控来专门分选表达ymNeongreen的菌株IMX2871。分选后，使用流式细胞术测量了两种菌株的相对丰度。在三个独立的单轮分选实验中，菌株IMX2871的丰度从初始的0.096%（1000分之1）富集到最终的78%±7%，相当于800倍的富集。

尽管使用荧光标记的酵母菌株来验证无标记富集方法，但这些结果证明了基于FACS的微珠可以用来从混合培养物中强烈富集特定酵母菌株，即使其在混合培养物中的丰度很低。

接下来的一系列实验旨在研究本研究提出的方法是否可以用来从混合群体中富集含有低丰度抑制剂耐受菌株的微珠，而不使用异源表达的荧光蛋白。为此，设计了实验来从含有G418敏感菌株CEN.PK113-7D的混合物中选择表达kanMX的抗G418的S. cerevisiae菌株IMI575。确定了抑制悬浮培养和微珠培养中生长的G418浓度（见图2）。在含有8%（重量/体积）葡萄糖的HCYP培养基上的摇瓶悬浮培养中，接种的细胞浓度相当于每个微珠一个细胞（3×10^7个细胞/毫升）。高糖浓度是为了确保微珠内的菌株能够充分生长，以便区分有生长和无生长的微珠。在200到600微克/毫升的G418浓度范围内，悬浮培养中的细胞浓度在孵育后与接种后立即测量的细胞浓度保持不变（见图2a）。

图2分析了不同G418浓度下悬浮培养和微珠培养的生长抑制情况。a 在不同G418浓度（微克/毫升）下测量的G418敏感S. cerevisiae菌株IMX2871悬浮培养中的细胞浓度（细胞/微升）。虚线表示接种物的细胞浓度，相当于每个微珠一个细胞。b 在G418存在下有生长的微珠百分比，相对于无G418时有生长的微珠比例进行了归一化。微珠以λ值为0.2接种了G418敏感菌株IMX2871（黄色条形）或G418抗性菌株IMI575（紫色条形），并孵育40小时。

在悬浮培养中评估的相同G418浓度范围内，也在λ值为0.2的微珠培养中进行了测试。为了量化G418的抑制作用，首先使用流式细胞术确定了显示生长的微珠百分比（见图1，并按照补充材料第5节中的方法进行门控）。然后将G418存在下显示生长的微珠比例与无抗生素时观察到的比例进行了归一化（见图2b）。尽管数据有所变化，但在悬浮培养中使用的相同200到600微克/毫升的G418浓度范围内，仍然观察到抗性菌株IMI575在微珠中的明显生长（见图2b）。与悬浮培养不同，G418敏感菌株IMX2871的微珠培养在200和400微克/毫升的G418浓度下也显示出生长。然而，在微珠培养中，600微克/毫升的G418浓度足以阻止敏感菌株的生长（见图2b）。随后评估了G418敏感S. cerevisiae的微珠培养在600微克/毫升G418暴露下是否被杀死或仅被抑制。为此，将含有G418的微珠培养和不含G418的微珠培养接种了敏感菌株CEN.PK113-7D。经过40小时孵育后，将对应于单细胞和接种了细胞的微珠事件（按照补充材料第5节中的方法进行门控）放置在非选择性平板上以检查生长情况。在无G418培养中生长的分选事件中，71%±4%产生了菌落形成单位，而在添加了G418的培养中分选的事件中没有产生任何菌落形成单位（见补充材料第6节）。这些结果表明，只有G418抗性菌株能够在微珠中存活并经过后续分选。

为了评估当含有G418抗性菌株的微珠仅占接种微珠总比例的一小部分时，是否可以通过FACS进行选择，准备了抗性菌株IMI575和敏感菌株CEN.PK113-7D的混合物，比例为1:102、1:103和1:104（见图3）。然后以λ值为0.2将这些混合物接种到微珠中。孵育40小时后，选择了具有最高自荧光和侧向散射信号的微珠。在所有初始菌株比例下，都观察到了抗性菌株IMI575的显著富集。进行了四次独立的重复分选实验，初始菌株混合物中含有0.72%±0.03%的抗性细胞。在每次重复分选实验中，都分选出了具有生长的微珠。所有产生的菌落都是抗性细胞（100%±0%）（见图3）。同样，在含有0.059%±0.025%抗性细胞的四种不同分选实验中，98.60%±2.42%的菌落是抗性细胞（见图3）。在最极端的情况下，初始抗性菌株比例为0.0063±0.0026%，在三次不同的分选实验中，所有产生的菌落都是抗性细胞（见图3）。

图3显示了微珠分选前后G418抗性S. cerevisiae菌株IMI575的倍数变化和比例。抗性菌株IMI575与敏感菌株CEN.PK113-7D的混合比例（1:102、1:103和1:104）对应的平均测量比例为1:139±6（两种混合物）、1:2037±846（两种混合物）和1:19,135±7879（两种混合物）。微珠以λ值为0.2接种这些菌株混合物，并在含有G418的培养基中孵育。孵育40小时后，对有生长的微珠进行分离。每个条形图代表四次分离实验（1:102和1:103）或三次实验（1:104）的平均值。在分离前后，对耐药性和敏感性菌株的相对丰度进行了量化。

结果表明，从含有低浓度敏感菌株（1:104）的混合物中，通过单轮分离可以将接种了G418抗性菌株的微珠富集16,000倍。早期的生存能力评估显示，在这些条件下，G418敏感菌株在暴露于G418后无法恢复，这解释了即使存在已知的分离效率低下，分离后仍观察到高富集现象。

为了评估所提出的从微珠培养物中富集特定低丰度表型的方法是否可以用于选择对非致命性代谢物2-脱氧葡萄糖具有抗性的细胞，使用2-脱氧葡萄糖作为模型代谢物。2-脱氧葡萄糖是一种葡萄糖类似物，其第二个碳原子上缺少羟基，因此可以抑制其他碳源的利用（Laussel和Léon 2020）。2-脱氧葡萄糖常用于选择酵母突变体，因为这些突变体由于葡萄糖分解代谢的抑制得到缓解，可以在葡萄糖存在的情况下转化其他碳源（Neigeborn和Carlson 1987；McCartney等人2014a；Soncini等人2020）。

为了确定抑制蔗糖培养基中悬浮培养物生长的2-脱氧葡萄糖浓度（图4a），批量培养物接种了敏感的S. cerevisiae菌株CEN.PK113-7D或hxk2?-抗性菌株IMX2748。该抗性菌株缺乏Hxk2基因，因为这种缺失已被证明可以使菌株在蔗糖存在的情况下对2-脱氧葡萄糖产生抗性。对于Hxk2缺失导致毒性降低的几种假设包括：2-脱氧葡萄糖-6-磷酸的磷酸化减少（McCartney等人2014b；Soncini等人2020；Schmidt和O’Donnell 2021）、蔗糖转化酶（Suc2）的抑制得到缓解（Neigeborn和Carlson 1987；Soncini等人2020）和/或通过表达2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酶对2-脱氧葡萄糖-6-磷酸进行解毒（Laussel和Léon 2020）。微珠培养物以每微珠一个细胞的浓度接种。在2-脱氧葡萄糖浓度为0.5 g/L或更高时，CEN.PK113-7D的细胞数量没有增加（图4a和b）。在类似的hxk2?菌株IMX2748实验中，所有测试的2-脱氧葡萄糖浓度下都观察到了明显的生长，尽管最终细胞浓度与2-脱氧葡萄糖浓度呈负相关（图4b）。这种相关性可能是由于2-脱氧葡萄糖的毒性，细胞仍然会吸收它，并且由于己糖激酶的磷酸化作用，导致不可代谢中间产物的积累和ATP耗尽（Laussel和Léon 2020；Luzia等人2023）。

图4 分析了不同2-脱氧葡萄糖浓度下悬浮培养物和微珠培养物的生长抑制情况。a 在不同2-脱氧葡萄糖浓度（g/L）下，2-脱氧葡萄糖敏感菌株CEN.PK113-7D（黄色条形图）和2-脱氧葡萄糖抗性菌株IMX2748（紫色条形图）的悬浮培养物中的细胞浓度（细胞/μL）。虚线表示接种物的细胞浓度，即每个微珠一个细胞。b 在2-脱氧葡萄糖存在下有生长的微珠百分比，相对于无2-脱氧葡萄糖时有生长的微珠比例进行归一化。微珠以λ=0.2接种2-脱氧葡萄糖敏感菌株CEN.PK113-7D（黄色条形图）或2-脱氧葡萄糖抗性菌株IMI602（紫色条形图），并孵育40小时。

为了测试2-脱氧葡萄糖对蔗糖培养的微珠培养物的生长抑制作用，它们以λ值为0.2接种了敏感的S. cerevisiae菌株CEN.PK13-7D或hxk2?-抗性菌株IMI602。通过流式细胞术根据自发荧光和侧散射信号（图1）分析了不同2-脱氧葡萄糖浓度下的生长情况。为了量化2-脱氧葡萄糖的抑制作用，我们首先估计了显示生长的微珠百分比（如补充材料Sect. 5中所示进行筛选）。然后，我们将2-脱氧葡萄糖存在下显示生长的微珠比例与无代谢物存在时观察到的比例进行归一化（图4b）。基于这些实验，选择了8 g/L的2-脱氧葡萄糖浓度进行进一步的微珠培养研究。与G418的情况类似，微珠培养物对2-脱氧葡萄糖的敏感性低于悬浮培养物（图4）。

为了评估2-脱氧葡萄糖对敏感菌株的影响，微珠在有无8 g/L抑制剂的情况下接种了敏感菌株CEN.PK113-7D。孵育40小时后，将FACS事件中识别为单个细胞和接种了细胞的微珠（如补充材料Sect. 5中所示进行筛选）接种在非选择性培养基平板上。从无2-脱氧葡萄糖培养的微珠培养物中筛选出的事件中，84±11%在平板上形成了菌落。而在有2-脱氧葡萄糖培养的微珠培养物中筛选出的事件中，只有9±6%形成了菌落（补充材料Sect. 6）。这些结果表明，只有少量的2-脱氧葡萄糖敏感菌株在微珠中与8 g/L 2-脱氧葡萄糖孵育后能够形成菌落。

为了测试对含有2-脱氧葡萄糖抑制抗性细胞的低丰度微珠群体的分离可行性，将抗性菌株IMI602和敏感菌株CEN.PK113-7D以1:103和1:104的比例混合。微珠以λ值为0.2接种这些混合物，并在孵育40小时后，选择了具有高自发荧光和侧散射信号的微珠。对于这两种初始菌株比例，该程序都实现了2-脱氧葡萄糖抗性菌株IMI602的富集。IMI602还被工程改造为对G418具有抗性，以便通过筛选抗生素抗性来确定分离前后的相对丰度。在每个单独的重复分离实验中，都筛选了有生长的微珠（如补充材料Sect. 5中所示进行筛选）。在最初含有0.12%±0.0076% IMI602的混合物中，从六个单独的重复分离实验中，抗性菌株被富集到7.15%±3.12%。同样，在含有0.0085%±0.00029%的混合物中，从三个单独的重复分离实验中，抗性菌株被富集到5.70%±3.77%（图5）。

图5 2-脱氧葡萄糖抗性S. cerevisiae菌株IMI602在微珠分离前后的倍数变化和比例。抗性菌株IMI575与敏感菌株CEN.PK113-7D的混合比例（1:103和1:104）对应的平均测量比例为1:806±50（两种混合物）和1:11,755±409（两种混合物）。微珠以λ=0.2接种这些菌株混合物，并在含有2-脱氧葡萄糖的培养基中孵育。孵育40小时后，对有生长的微珠进行分离。每个条形图代表六次分离实验（1:103）或三次实验（1:104）的平均值。在分离前后，对耐药性和敏感性菌株的相对丰度进行了量化。

结果表明，尽管抗性菌株的富集没有达到100%，但从初始菌株混合物中（其中抗性菌株约占1:104的比例）通过单轮分离实现了大约600倍的抗代谢物抗性菌株富集。早期的生存能力评估显示，在这些条件下，2-脱氧葡萄糖敏感菌株在暴露于2-脱氧葡萄糖后可以恢复。这与潜在的（共同）分离出待分离群体之外的群体一起，可以解释为什么在分离后仍然存在敏感菌株。

本研究的结果展示了在琼脂糖-微珠-油乳液中的培养结合无标记的高通量分离技术，能够快速高效地从大量细胞群体中选择出抗代谢物抗性的S. cerevisiae菌株。使用微珠通过将选择培养物的水相减少到0.3 mL来降低成本。在随后的分离步骤中，微珠中抗性细胞的富集程度达到了600到16,000倍，从而减少了在固体培养基或微量滴定板上的进一步选择所需的培养基量。这种方法有潜力大幅减少筛选过程中所需的抗代谢物和其他实验室消耗品的数量。找到一种无毒的替代品来替代培养步骤中使用的氟化油，对于进一步减少这种方法的环境影响是一个相关的挑战。通过使用自发荧光和侧散射信号作为生长指标，可以在不表达异源荧光蛋白的情况下对含有抗性细胞的微珠进行分离。在感兴趣的微生物的自发荧光信号太弱而无法用作生长微珠选择指标的情况下，可以使用由细胞代谢激活的荧光标记物（Maurice和Turnbaugh 2013；Kehe等人2019）作为替代方案。

尽管没有实现2-脱氧葡萄糖抗性菌株的完全富集，但观察到了600倍的富集。在最具有挑战性的情况下，初始抗性比例为0.0085%±0.00029%，抗性菌株被富集到5.70%±3.77%。这种预富集表明，将所提出的方法应用于突变体池可以大幅减少筛选工作量，从大约10^5个突变体减少到只有几百个。这样的显著减少使得使用96孔板等检测方法能够可行地识别感兴趣的突变体。预计后续的分离轮次将进一步增加富集程度。总的来说，使用抗代谢物2-脱氧葡萄糖的概念验证展示了尽管抗代谢物具有非致命效应，但仍能显著富集目标菌株。

使用水-油乳液意味着疏水性抗代谢物在油相中的分配可能会使这种方法的采用变得复杂。如果这个问题不能通过增加添加到检测中的抗代谢物量来解决，而不显著增加筛选成本，可以尝试通过添加牛血清白蛋白、调整表面活性剂浓度或化学修饰抗代谢物等方法来增加其在水相中的浓度（Gruner等人2016；Scheler等人2016；Skhiri等人2012）。乳液中的生长也可能受到氧气供应和pH等因素的影响。然而，只要细胞在微珠内进行足够的复制次数，这些变量不会影响富集结果，从而能够可靠地区分生长和未生长。

在微珠培养物中，G418和2-脱氧葡萄糖的最低抑制浓度（MICs）高于悬浮培养物。MIC值的上下文依赖性并不排除基于微珠的选择方法的使用，但由于基于它们的分配系数（LogP值分别为-1.37和-3.07），G418和2-脱氧葡萄糖应该留在水相中（ChemSpider 2025），因此在这项研究中并未预料到这一点。相反，微珠培养物和悬浮培养物中不同的MIC可能反映了微珠培养物的不同生理特性、抑制剂在乳液制备过程中的部分失活或降解，和/或与琼脂糖的结合。

在某些情况下，抑制剂完全阻止了敏感细胞的再生长，如本研究中使用抗生素G48进行选择时所观察到的，使用低体积悬浮培养物可能就足够了。然而，在悬浮培养物中的选择可能导致遗传多样性的丧失，因为生长最快的存活突变体会主导群体。通过在微珠中的空间分离来消除这种竞争，可以更代表性地采样突变体池的遗传多样性。

通过让2-脱氧葡萄糖抗性酵母细胞在蔗糖上生长来选择它们，蔗糖的利用在S. cerevisiae中被葡萄糖抑制（Raamsdonk等人2001；Kayikci和Nielsen 2015）。在S. cerevisiae中，蔗糖的代谢通过水解为果糖和葡萄糖开始，这一反应主要发生在细胞外（Basso等人2011）。在微珠乳液中，果糖和葡萄糖保留在水相中，这意味着它们只能被微珠内的克隆培养利用。这种资源私有化与悬浮培养和固体培养中的情况不同，在悬浮培养和固体培养中，所有细胞共享细胞外底物和细胞外酶。因此，本研究中描述的简单、无标记的选择和筛选方法可能适用于选择能够有效水解细胞外底物的微生物。例如，这种方法可能适用于改进用于联合生物处理的酵母菌株（即同时进行细胞外水解和聚合或寡聚糖的发酵；Gao等人2019）。

在设置微珠培养和分离策略时，我们使用了抗生素G418作为模型抑制剂。快速检测和识别临床分离株的有效抗生素方案对于及时治疗微生物感染至关重要。传统的检测方法通常需要较长的孵育时间才能达到可检测的细胞浓度（Boedicker等人，2008年；Agnihotri等人，2025年）。Boedicker等人（2008年）和Agnihotri等人（2025年）通过使用小体积限制装置来提高局部细胞浓度，从而解决了这一问题。然而，他们的方法需要专门的微流控设备和成像技术。本文介绍的更简单的微珠乳液方法可能提供了一种简单的高通量替代方案，只要具备流式细胞仪或FACS设备，就可以在临床实验室中轻松实施。总之，这种基于微珠的高通量筛选方法为富集抗代谢物的大肠杆菌菌株提供了一种无标记、成本更低的选择。该方法通过将一种2-脱氧葡萄糖（葡萄糖类似物）抗性的大肠杆菌菌株富集600倍，以及将一种G418（抗生素）抗性的大肠杆菌菌株富集16,000倍来验证其有效性。除了这一应用外，这种简单、无标记且高通量的设计还适用于筛选具有改进的胞外产物水解底物的突变体，并快速鉴定对临床分离株有效的抗生素方案。